李天洙 許青松 崔 永 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(延吉 133000)

樺褐孔菌(Inonotus obliquus,Chaga),主要分布于北緯 45～50度的地區(qū),如北美、芬蘭、波蘭、俄羅斯、日本等國家和地區(qū),在我國主要分布在黑龍江和吉林省長白山地區(qū),民間廣泛用于防治癌癥等多種疑難雜癥[1]。樺褐孔菌提取物具有很多生物活性,如增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗病毒(主要是 H IV)、抗氧化、抑制血小板聚集、抗炎、抗損傷等作用。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定糖尿病豚鼠 FBG、Hb A1c、TG、TC、LDL-C和 HDL-C等糖、脂代謝生化指標(biāo)及 GK、HM G Co A還原酶表達(dá),初步探討樺褐孔菌水提取物糾正糖尿病豚鼠糖、脂類代謝紊亂的生物化學(xué)機(jī)制,為樺褐孔菌的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1 動(dòng)物雄性豚鼠 80只,體重 400～500g,由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥 樺褐孔菌水提取物,由延邊圣林菌業(yè)有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 STZ(美國 Sigma公司),蛋白質(zhì)提取純化試劑盒(Bioss p1250),GK和 HM G CoA還原酶單克隆抗體(Santa Cruz,USA);其他試劑均應(yīng)用國產(chǎn)優(yōu)級(jí)純?cè)噭?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器全自動(dòng)生化分析儀(日立7600),糖化血紅蛋白分析儀(Sysmex GT),電泳裝置(Bio-rad)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果 2.1 制作糖尿病豚鼠模型 糖尿病豚鼠模型制備采用楊麗萍等方法[2],取 FBG≥8.83mmol/L者作為糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)。取造模成功的糖尿病豚鼠 48只(本實(shí)驗(yàn)造模成功 54只),按血糖和體重隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(模型組)、樺褐孔菌水提取物小劑量組、中劑量組、大劑量組及陽性對(duì)照組(鹽酸二甲雙胍治療組),每組各 8只 ,樺褐孔菌小劑量組、中劑量組、大劑量組分別灌胃樺褐孔菌水提取物 300mg/kg、600mg/kg、900mg/kg。陽性對(duì)照組灌胃鹽酸二甲雙胍200mg/kg,正常對(duì)照組和糖尿病模型組每天灌胃相同劑量的蒸餾水 1次,連續(xù) 8周。實(shí)驗(yàn)期間飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水及新鮮蔬菜。實(shí)驗(yàn)前取眥靜脈測(cè)定各組 FBG、TG、TC、LDL-C和HDL-C水平。實(shí)驗(yàn) 8周后,各組禁食不禁水 12h,麻醉后心臟取血測(cè)量 FBG、Hb A1c、TG、TC、LDL-C和 HDL-C水平,取豚鼠肝臟,蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定 GK和 HM G CoA還原酶的表達(dá),以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。

2.2 實(shí)驗(yàn)組 FBG和 Hb A1c的變化實(shí)驗(yàn)前后相比較,陽性對(duì)照組的 FBG水平顯著下降 (P＜0.01),樺褐孔菌水提取物大、中劑量組的 FBG均明顯下降(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)后與陰性對(duì)照組比較,陽性對(duì)照組的 FBG水平顯著下降(P＜0.01),樺褐孔菌水提取物大、中劑量組的 FBG均明顯下降(P＜0.05),與陰性對(duì)照組比較,陽性對(duì)照組和樺褐孔菌水提取物大、中劑量組的 Hb A1c均明顯下降(P＜0.05),并表現(xiàn)出濃度梯度依賴性。陽性對(duì)照組與樺褐孔菌水提取物大、中劑量組的 Hb A1c水平比較無顯著變化,結(jié)果見表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)前后 FBG的比較和實(shí)驗(yàn)后 FBG及 HbA 1c的比較(±s)

表1 各實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)前后 FBG的比較和實(shí)驗(yàn)后 FBG及 HbA 1c的比較(±s)

注:實(shí)驗(yàn)前后比較,△P＜0.05,▲P＜0.01;與陰性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)后比較,◇P ＜0.05,◆P＜0.01。

正常組8 6.27± 0.386.74± 0.34 8.68± 0.65陰性對(duì)照組8 11.68±0.9612.27± 0.53 22.32±1.46陽性對(duì)照組8 12.09± 1.138.62± 1.52▲◆ 14.63± 1.84◇藥物小劑量組8 11.95±1.2911.52± 1.44 20.56±1.82藥物中劑量組8 11.38± 1.01 10.21± 1.37△◇ 17.47± 1.73◇藥物大劑量組8 12.14± 1.289.69± 1.25△◇ 15.73± 1.59◇

2.3 實(shí)驗(yàn)組 TG、TC的變化實(shí)驗(yàn)前后相比較,陽性對(duì)照組和樺褐孔菌水提取物大劑量組的 TG水平均顯著減少(P＜0.01),樺褐孔菌水提取物中劑量組的 TG水平均明顯減少(P＜0.05),陽性對(duì)照組和樺褐孔菌水提取物大、中劑量組的TC水平均顯著減少(P＜0.01);實(shí)驗(yàn)后,與陰性對(duì)照組比較,陽性對(duì)照組和樺褐孔菌水提取物大劑量組的 TG水平顯著減少(P＜0.01),樺褐孔菌水提取物中劑量組的 TG水平均明顯減少(P＜0.05),陽性對(duì)照組和樺褐孔菌水提取物大、中劑量組的 TC水平均顯著減少(P＜0.01),并表現(xiàn)為濃度梯度依賴性。結(jié)果見表2。

表2 各實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)前后 TG、TC的比較和實(shí)驗(yàn)后 TG、TC的比較±s)

表2 各實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)前后 TG、TC的比較和實(shí)驗(yàn)后 TG、TC的比較±s)

注:實(shí)驗(yàn)后與實(shí)驗(yàn)前比較,△P＜0.05,▲P＜0.01;與陰性對(duì)照組比較,◇P＜0.05,◆P＜0.01。

TG(mmol/L)TC(mmol/L)分 組n實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)后實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)后正 常組8 1.59± 0.071.61± 0.05 1.08± 0.361.11± 0.27陰性對(duì)照組8 2.01± 0.101.89± 0.08 2.16± 0.052.23±0.13陽性對(duì)照組8 1.88± 0.061.47± 0.11▲◆ 2.11± 0.080.87± 0.12▲◆藥物小劑量組8 1.91±0.121.79±0.09 2.06±0.141.69±0.09藥物中劑量組8 1.93± 0.051.58± 0.07△◇ 1.98± 0.111,41±0.07▲◆藥物大劑量組8 1.89± 0.091.36± 0.11▲◆ 2.02± 0.130.89±0.11▲◆

2.4 實(shí)驗(yàn)組 LDL-C及 HDL-C的變化 實(shí)驗(yàn)前后相比較,陽性對(duì)照組和樺褐孔菌水提取物大劑量組的 LDL-C水平顯著下降(P＜0.01),樺褐孔菌水提取物中劑量組的 LDL-C均明顯下降(P＜0.05),陽性對(duì)照組和樺褐孔菌水提取物大劑量組的 HDL-C水平顯著下降(P＜0.01),樺褐孔菌水提取物中劑量組的 HDL-C均明顯下降(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)后,與陰性對(duì)照組比較,陽性對(duì)照組和樺褐孔菌水提取物大劑量組的 LDL-C水平顯著下降(P＜0.01),樺褐孔菌水提取物中劑量組的 LDL-C均明顯下降(P＜0.05),陽性對(duì)照組和樺褐孔菌水提取物大劑量組的 HDL-C水平顯著下降(P＜0.01),樺褐孔菌水提取物中劑量組的 HDL-C均明顯下降(P＜0.05),并表現(xiàn)出濃度梯度依賴性,結(jié)果見表3。

表3 各組實(shí)驗(yàn)前后 LDL-C及 HDL-C的比較和實(shí)驗(yàn)后 LDL-C及 HDL-C的比較(±s)

表3 各組實(shí)驗(yàn)前后 LDL-C及 HDL-C的比較和實(shí)驗(yàn)后 LDL-C及 HDL-C的比較(±s)

注:實(shí)驗(yàn)后與實(shí)驗(yàn)前比較,△(P＜0.05),▲P＜0.01;與陰性對(duì)照組比較,◇P＜0.05,◆P＜0.01。

LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)分 組n實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)后實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)后正 常組8 0.75± 0.180.71± 0.31 0.45± 0.140.51± 0.23陰性對(duì)照組8 2.68± 0.262.57± 0.13 1.74± 0.211.69±0.16陽性對(duì)照組8 2.59± 0.141.21± 0.22▲◆ 1.69± 0.140.85± 0.14▲◆藥物小劑量組8 2.65±0.292.36±0.21 1.79±0.291.53±0.07藥物中劑量組8 2.58± 1.011.96± 0.37△◇ 1.65± 1.011.37±0.23△◇藥物大劑量組8 2.63± 0.251.49± 0.29▲◆ 1.71± 0.251.03±0.19▲◆

2.5 各實(shí)驗(yàn)組 GK和 HM GCoA還原酶表達(dá)的變化 實(shí)驗(yàn)后,各實(shí)驗(yàn)組 GK和 HMG CoA還原酶表達(dá)情況見圖 1,樺褐孔菌水提取物中、高劑量組 GK表達(dá)高于陰性對(duì)照組,表現(xiàn)濃度梯度依賴性。陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組及正常組比較 GK表達(dá)無明顯差異,樺褐孔菌水提取物高劑量組 GK表達(dá)高于陽性對(duì)照組。與此相反,樺褐孔菌水提取物治療組的 HMG CoA還原酶表達(dá)呈濃度依賴性減少,樺褐孔菌水提取物高劑量組的HM G Co A還原酶表達(dá)均低于陰性對(duì)照組、正常組和陽性對(duì)照組表達(dá),其中陰性對(duì)照組的 HM G Co A還原酶的表達(dá)量最多。

圖1 樺褐孔菌水提取物對(duì)GK和HMGCoA還原酶表達(dá)的影響（蛋白印跡）

3 討 論 糖尿病是一種內(nèi)分泌代謝紊亂引起的代謝性疾病,由于胰島素 /胰高血糖素比值降低,脂肪分解加速,大量脂肪酸和甘油進(jìn)入肝臟,過多的脂肪酸重新酯化成甘油三酯釋放入血,形成高脂血癥,酮血癥等并發(fā)癥。糖尿病病人由于體內(nèi)生長素、腎上腺素、去甲腎上腺素等激素增多,使膽固醇合成的限速酶-HMG CoA還原酶增加,膽固醇合成增加,增加了動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的危險(xiǎn)性。己糖激酶是葡萄糖分解的關(guān)鍵酶,共有四種亞型,其中存在于肝臟中的己糖激酶稱為葡萄糖激酶。葡萄糖激酶的表達(dá)受 PPARγ等因子的調(diào)節(jié)作用[3],在保持血糖的穩(wěn)定方面起著重要作用。為了探討樺褐孔菌對(duì)糖尿病豚鼠降糖、降脂過程的影響,實(shí)施了本次實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)利用豚鼠制作 STZ糖尿病模型,基于 STZ具有能夠直接破壞胰島細(xì)胞導(dǎo)致胰島功能衰竭,對(duì)其他組織毒性相對(duì)較少,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率高的特點(diǎn),及豚鼠和其他嚙齒類動(dòng)物比較,具有對(duì)藥物非常敏感的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明,樺褐孔菌中、高劑量組的 FBG、HbA1c、TG、TC、LDLC和 HDL-C水平明顯減少,并且具有濃度梯度依賴性,提示樺褐孔菌提取物對(duì)糖尿病豚鼠的降低血糖及血脂具有較好的療效,這些內(nèi)容和張香花等研究結(jié)果吻合[4,5,6]。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明,樺褐孔菌可增強(qiáng) GK表達(dá),降低 HMGCoA還原酶表達(dá)。推測(cè),GK表達(dá)增強(qiáng),對(duì)降低血糖具有促進(jìn)作用,而血糖水平的改善,可以通過影響體內(nèi)多種激素的代謝,改變 HMGCoA還原酶的表達(dá)水平,減少膽固醇的合成。樺褐孔菌含有三萜類、類固醇、甾醇類、多糖類、木質(zhì)素類、黑色素類、多酚類、鞘氨脂類似物、甘露醇、半單寧化合物、栓菌酸、生物堿、葉酸衍生物以及芳香物質(zhì)等多種化學(xué)成分。樺褐孔菌提取物能夠影響 GK和 HMGCoA還原酶表達(dá),是否和這些單體成分有關(guān),這些成分是否以單體或復(fù)合體的形式參與這些蛋白質(zhì)表達(dá)的信號(hào)傳導(dǎo)通路或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程,還有待于進(jìn)行其他的相關(guān)實(shí)驗(yàn)加以確定。以上分析可以推測(cè),樺褐孔菌水提取物對(duì)糖尿病豚鼠降低血糖、血脂水平具有較好療效,其機(jī)制之一可能是通過對(duì) GK表達(dá)的影響,降低血糖水平,影響體內(nèi)相關(guān)激素水平,進(jìn)而通過改變 HMGCoA還原酶表達(dá)或單獨(dú)影響 HMGCoA還原酶的表達(dá),達(dá)到防治糖尿病的目的。

[1]黃年來.俄羅斯神秘的民間藥用真菌-樺褐孔菌 [J].中國食用菌,2002,21(4):7-8.

[2]楊麗萍,周文江,衛(wèi)志明.鏈脲佐菌素誘發(fā)豚鼠糖尿病模型的研制[J].上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),2001,21(2):111-112.

[3] So-younKim,Ha-ilKim,Sang-KyuPark,etral.LiverGlucokinaseCanBeActivatedbyPeroxisome Proliferator-ActivatedReceptor-γ,DIABETES,2004,53(S1);S66-S70.

[4] 潘艷玲,凌湘力.芪荷地黃湯防治糖尿病脂代謝紊亂的實(shí)驗(yàn)研究 [J].陜西中醫(yī),2008,29(9):1245-1246.

[5]楊景鋒,趙天才,白海俠,等.抵當(dāng)四五湯對(duì)糖尿病血管病變大鼠血液流變性的影響 [J].陜西中醫(yī),2008,29(8):1077-1078.

[6] 張香花,孫東植,陳海月,等.樺褐孔菌提取物對(duì)糖尿病大鼠生化指標(biāo)的影響[J].中國食用菌,2008,27(5):41-43.