尹思源 郭建敏 席新龍 廖慧玲 瀘州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 (瀘州 646000)

據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測,至 2020年非傳染性疾病將占我國疾病死因的 79%,其中心血管疾病將占首位。高血壓是常見的心血管疾病之一,是全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題。近年來,隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,對高血壓病的研究越來越深入,認(rèn)為炎癥因子與高血壓病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。本實驗通過使用蛭龍活血通瘀膠囊治療腎性高血壓大鼠,觀察炎癥因子IL-6和 CRP在治療前后的變化,旨在探討蛭龍活血通瘀膠囊的降壓機(jī)制,為進(jìn)一步闡明高血壓的發(fā)展與炎性反應(yīng)的關(guān)系提供參考。

1 材料與方法 1.1 實驗動物 2月齡健康 SD大鼠80只,雄性,體重(200±30)g,由華西醫(yī)學(xué)動物中心提供,均為一級合格動物,合格證號為:080415。

1.2 實驗藥物 蛭龍活血通瘀膠囊主要由水蛭、地龍、黃芪、大血藤、桂枝等組成,每粒 0.4g(相當(dāng)于生藥 2.6g),由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。臨用時用溫開水配成80mg/m L、 160mg/m L、 320mg/m L的混懸液。批號:20070528。

1.3 腎性高血壓模型建立 取 SD雄性大鼠 80只,適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng) 1周后,采用 ZH-HX-Z無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)測每只大鼠的基礎(chǔ)血壓 ,禁食不飲水 24h之后,留 10只大鼠作為正常對照組,另 70只大鼠在室溫下進(jìn)行手術(shù),具體步驟:2%巴比妥鈉45mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠,仰臥固定于手術(shù)臺上,腹部備皮,常規(guī)消毒后,蓋上孔巾沿腹正中線切開,打開腹腔,小心鈍性分離出左腎動脈,然后穿入無菌的線絲,把直徑為 0.25mm的針灸針與腎動脈血管長軸平行放置,用無菌線絲扎緊腎動脈和針灸針然后抽出針灸針,結(jié)果造成腎動脈狹窄,對側(cè)腎臟和動脈不觸及,然后逐層關(guān)閉腹腔,術(shù)后 3d每天腹腔注射青霉素3×104U/d,預(yù)防感染,共 3d;假手術(shù)組方法同模型組 ,但只分離左腎動脈,不結(jié)扎。根據(jù)腎性高血壓模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn),于2周后測量大鼠血壓,每次 3次求其平均值,以收縮壓高于基礎(chǔ)血壓 20mm Hg,且收縮壓高于 115mmHg者被認(rèn)為造模成功[2]。

1.4 動物分組與給藥 選取 2月齡健康雄性 SD大鼠 80只,隨機(jī)分為正常組 10只與手術(shù)組 70只,手術(shù)組采用結(jié)扎左側(cè)腎動脈的方法建立腎性高血壓大鼠模型,其中假手術(shù)組 10只,只分離左側(cè)腎動脈不結(jié)扎,兩周后采用尾套法測定大鼠血壓,將手術(shù)后符合高血壓標(biāo)準(zhǔn)的大鼠 40只隨機(jī)分為四組 ,即模型組,高劑量組,中劑量組,低劑量組,每組 10只。假手術(shù)組與正常對照組每組 10只。普通飼養(yǎng) 4周后,蛭龍活血通瘀膠囊組根據(jù)高、中、低劑量分別給予 1.6g/kg、0.8g/kg、0.4g/kg灌胃,1次 /d,共 8周。模型組、假手術(shù)組和正常對照組大鼠給予等容積的生理鹽水。每周稱大鼠體重 1次,根據(jù)體重隨時調(diào)整給藥量。

1.5 觀察指標(biāo) 1.5.1 大鼠血壓的測定:用小型電吹風(fēng)適當(dāng)?shù)慕o大鼠尾部加熱,以擴(kuò)張局部血管,加熱程度視大鼠尾巴皮膚變?yōu)槲⒓t,采用 ZH-HX-Z無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng) (安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)測每只大鼠的血壓,每次測 3次求其平均值作為該樣本的血壓。

1.5.2 血清 IL-6及 CRP的檢測:最后一次灌胃結(jié)束后1h,稱體重后,麻醉大鼠,開胸,下腔靜脈取血約 3～5m L,靜置4h,以 1500r/m in離心 10min,制備血清 ,放置在-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?個月內(nèi)采用 ELISA法測定血清 IL-6含量,試劑盒購于美國 ADL公司。采用放射免疫法測定血清 CRP含量,試劑盒購于中國人民解放軍總醫(yī)院。

2 結(jié) 果 2.1 對大鼠腎性高血壓血壓的影響 見表1。各組大鼠的基礎(chǔ)血壓之間無明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。手術(shù)后 2周血壓,模型組、高劑量組、中劑量組及低劑量組血壓較正常組均明顯偏高(P＜0.05),且模型組和各用藥組血壓均超過 115mm Hg,與基礎(chǔ)血壓的差值均大于 20mm Hg,根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)[2],說明用藥組及模型組的腎性高血壓造模成功。假手術(shù)組較正常組無明顯變化(P＞0.05),表明手術(shù)對血壓無明顯的影響。

治療 8周后血壓,與模型組比較,高劑量組、中劑量組血壓較模型組明顯降低有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),低劑量組較模型組降低不明顯無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);高劑量組、中劑量組與低劑量組比較有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),高劑量組與中劑量組之間比較無明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠收縮壓的變化(mm Hg,±s)

表1 各組大鼠收縮壓的變化(mm Hg,±s)

注:△與正常組比較 P＜0.05;▲與模型組比較 P＜0.05;◇與假手術(shù)組比較 P＜0.05;◆與低劑量組比較 P＜0.05。

組 別n劑量(g/kg)基礎(chǔ)血壓(mm Hg)手術(shù)后兩周血壓(mm Hg)治療八周后血壓(mm Hg)正 常組10--91.8± 3.3589.9± 2.5990± 2.92假手術(shù)組10--93.4± 2.6192.4± 4.6292.4± 3.44模型組10--94.1±6.28130.4±8.72△142.7±8.67△◇高劑量組101.694.6± 7.17129± 7.35△102± 6.28△▲◇◆中劑量組100.890.0± 3.71125± 7.23△102± 5.41△▲◇◆低劑量組100.494.0± 4.52128.2± 9.59△138± 5.63△◇

表2 各組大鼠血清 CRP、IL-6水平的變化±s)

表2 各組大鼠血清 CRP、IL-6水平的變化±s)

注:△與正常組比較 P＜0.05;▲與模型組比較 P＜0.05;◇與假手術(shù)組比較 P＜0.05;◆與低劑量比較 P＜0.05。

組 別n劑量(g/Kg)CRP(ng/m l)IL-6(ng/m l)正常組10-4.12± 0.091.03±0.10假手術(shù)組10-4.23± 0.071.25±0.09模型組10-7.80±0.68△◇8.53±2.00△◇高劑量組10 1.65.92±0.29▲△◇◆4.26± 0.63▲△◇◆中劑量組10 0.86.12±0.18▲△◇◆4.50± 0.66▲△◇◆低劑量組10 0.47.68± 0.96▲△7.36± 0.35△▲

2.2 對大鼠腎性高血壓 IL-6和 CRP的影響 見表2。模型組與正常組、假手術(shù)組比較 ,血清中 IL-6、CRP濃度均明顯增高有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),高劑量組、中劑量組及低劑量組與模型組比較,高劑量組與中劑量組明顯降低有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),低劑量組降低不明顯無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05),高劑量組、中劑量組與低劑量組比較降低有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),高劑量組與中劑量組之間比較無明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討 論 高血壓的發(fā)病機(jī)制及病理過程至今尚未完全闡明,近年來學(xué)術(shù)界認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞功能異常在其發(fā)病中起著重要的作用。血管壁增厚和血管內(nèi)皮細(xì)胞受損造成血管硬化和周圍血管阻力增加,是高血壓發(fā)生、發(fā)展的重要原因。細(xì)胞因子是機(jī)體免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞合成的分泌調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能的小分子多肽,具有高效性、多向性、內(nèi)生性等特點。包括白介素(IL)、C反應(yīng)蛋白(CRP)等。據(jù)報道,細(xì)胞因子在內(nèi)皮細(xì)胞增殖調(diào)控中起著重要的作用,他們可能參與了高血壓的發(fā)生和發(fā)展的過程。

IL-6是由活化的 T細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等產(chǎn)生的,是一種調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)和造血作用的多肽遞質(zhì)。Cymerys等[3]認(rèn)為高血壓存在急性期反應(yīng),引起高血壓急性期反應(yīng)最重要的是 IL-6。IL-6能夠誘導(dǎo)纖維蛋白原啟動凝血因子 ,使血管炎癥部位的纖維母細(xì)胞增生,膠原沉積;它還有較強(qiáng)的血小板活化因子的特性,通過激活血小板促進(jìn)血小板聚集,導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損害。IL-6和 TNF顯著增加高血壓患者紅細(xì)胞內(nèi) Ca2+依賴的 K+外流和細(xì)胞膜對 Ca2+通透性,導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流增加,平滑肌收縮,血壓升高。薛冰等[4]的研究表明高血壓患者血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)可以產(chǎn)生大量的 TNF和血小板衍化生長因子,TN F和 PDGF可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞產(chǎn)生 IL-6,而 IL-6又能促使平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖,導(dǎo)致產(chǎn)生大量的 PDGF,最終導(dǎo)致周圍血管阻力增高,引起高血壓。由此可見,IL-6可通過多種途徑參與高血壓病的發(fā)生發(fā)展。CRP是一種炎癥反應(yīng)時相蛋白,血液中的 CRP主要由肝臟合成,IL-1、IL-6和 TN F-α能刺激肝臟和上皮細(xì)胞合成和分泌包括 CRP在內(nèi)的急性時相蛋白 ,其中 IL-6是刺激 CRP產(chǎn)生的最主要的細(xì)胞因子。Sung等[5]認(rèn)為 CRP是高血壓發(fā)生與發(fā)展的一種獨立危險因素。 CRP損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞釋放的NO及前列腺素減少,使其血管舒張、抗血栓、抗病原的特性喪失,這些喪失在高血壓的病理過程中起重要作用[6]。炎癥介質(zhì)可以激活內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和多形核白細(xì)胞釋放內(nèi)皮素-1及內(nèi)皮素-1免疫樣激活物 ,使血管收縮,血壓升高[7]。高濃度的血清 CRP可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移、動脈內(nèi)膜增厚,促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成發(fā)展,導(dǎo)致血管重構(gòu)阻力增加[8]。高濃度CRP直接參與局部和全身炎癥反應(yīng)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,使血管對內(nèi)皮依賴性舒血管物質(zhì)的反應(yīng)性減弱 ,血管阻力增加[9]。

祖國醫(yī)學(xué)無“高血壓”病名,根據(jù)高血壓病患者臨床多見頭痛、眩暈等癥狀,把高血壓歸屬于“頭痛”“眩暈”等證范疇。歷代醫(yī)家均認(rèn)為瘀血在高血壓病中作用的重要性,病認(rèn)為瘀血貫穿在整個病變過程中。我們結(jié)合臨床和大量的文獻(xiàn)研究,認(rèn)為“脈絡(luò)瘀阻、血行郁滯”在高血壓病的發(fā)病過程中占有重要的作用,貫穿于高血壓病全過程。程志清等[10]報道在高血壓病的治療中運(yùn)用活血化瘀法有如下重要作用:通過改善血液粘稠度與微循環(huán)血液的濃、粘、聚、凝狀態(tài),使外周阻力減小,血流動力學(xué)平衡得以正常而使血壓下降;改善血管內(nèi)皮功能,調(diào)節(jié)血管緊張素II與一氧化氮水平來達(dá)到擴(kuò)張血管、防止內(nèi)膜增生降低血壓的目的。本研究中蛭龍活血通瘀膠囊是由水蛭、黃芪、地龍、大血藤等組成。針對瘀血這一基本病機(jī),以水蛭活血化瘀,黃芪益氣為君,以地龍活血化瘀、通行經(jīng)絡(luò),大血藤通絡(luò)、祛風(fēng),佐以溫藥桂枝,溫通經(jīng)脈,體現(xiàn)“血得溫則行,得寒則凝”之意,諸藥同用,共奏活血、益氣、通絡(luò)之功。現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為:水蛭具有抗凝,抗血栓,降低血壓、血脂以及改善血流動力學(xué)的作用,以及降低炎性細(xì)胞因子 TNF-α及 IL-1β的作用;黃芪具有抗血小板聚集,降低血壓以及降低高血壓患者血清中 hs-CRP、TNF-α、IL-1β及 IL-6水平的作用;地龍具有抗血栓、溶血栓作用,且具有降壓作用;大血藤具有抗凝作用,抗菌消炎作用。本實驗研究發(fā)現(xiàn),蛭龍活血通瘀膠囊能降低大鼠腎性高血壓血壓及IL-6和CRP水平,從而有效的防止血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,阻止血液的高凝狀態(tài)的發(fā)生,這可能是蛭龍活血通瘀膠囊防治高血壓病的機(jī)制之一,其可能與中藥的多靶點、多層次、多途徑作用有關(guān),其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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