王亮亮,王 哲,高旭紅,李黎黎,馬中子,孟憲峰

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的一個(gè)重要成員,廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用并對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能有重要的作用[1-2]。同時(shí),研究還發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病 (Alzheimer disease,AD)患者海馬、皮質(zhì)、基底前腦神經(jīng)元中 BDNF和它的受體 (tyrosinekinaseB,trkB)表達(dá)明顯下降,提示BDNF可能與 AD呈一定的相關(guān)性[3-5]。因此探討 BDNF在 AD患者腦內(nèi)表達(dá)下降的原因,并尋找有效藥物以抑制細(xì)胞內(nèi)下調(diào)BDNF表達(dá)的信號(hào)通路或增加細(xì)胞內(nèi) BDNF表達(dá)成為治療 AD的措施之一。鹽酸多奈哌齊 (donepezil,DN)作為一種乙酰膽堿酯酶抑制劑廣泛用于 AD的治療,近幾年的研究發(fā)現(xiàn)除以上的機(jī)制外,其對(duì) AD神經(jīng)元還有保護(hù)作用,使神經(jīng)元免于丟失[6]。但其是否能通過(guò)影響 AD患者腦內(nèi) BDNF的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的研究還較少,故本研究通過(guò)向大鼠側(cè)腦室注射微量 Aβ25-35建立 AD動(dòng)物模型[7],然后予以 DN治療,通過(guò)免疫組化及免疫印跡方法觀察大鼠海馬區(qū) BDNF的表達(dá)變化,以期探討 DN對(duì) AD腦內(nèi)神經(jīng)元保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 相同環(huán)境下飼養(yǎng)的清潔級(jí)雄性 Wistar大鼠 24只 (中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部,許可證號(hào):SYXK[遼]2003-0013),3月齡,體質(zhì)量 (200±20)g,采用數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和干預(yù)組。

1.2 手術(shù)及給藥方式 采用大鼠側(cè)腦室內(nèi)定點(diǎn)注射方法:用0.9%氯化鈉溶液將 Aβ25-35制備成質(zhì)量濃度為 2μg/μl的Aβ25-35溶液,37℃孵育 1周,形成聚合狀態(tài)的 Aβ25-35[8]。模型組大鼠經(jīng)水合氯醛 (30mg/kg)麻醉后,備皮,置于腦立體定位儀上,固定頭部。常規(guī)消毒皮膚,沿顱頂中線剪開皮膚,暴露頭骨及前囟,參照 George等[9]介紹的方法選定側(cè)腦室注射位點(diǎn)。于前囟后 0.8mm,矢狀縫旁 1.5mm處,用牙科鉆鉆開顱骨,微量加樣器吸取 Aβ25-35溶液 7.5μl,垂直進(jìn)針,達(dá)蛛網(wǎng)膜下 3.0mm處,緩慢注射,5min內(nèi)完成,留針 5min后取出。對(duì)照組給予同等劑量的 0.9%氯化鈉溶液。清潔創(chuàng)面后縫合皮下組織和皮膚,對(duì)合好切口,強(qiáng)力碘消毒,待大鼠清醒后放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。干預(yù)組造模后腹腔注射 DN 1.5mg·kg-1·d-1,連用 4周;對(duì)照組、模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行腹腔注射。

1.3 免疫印跡法檢測(cè) BDNF的表達(dá) 大鼠頸椎脫臼處死,斷頭,剝離并取出雙側(cè)海馬結(jié)構(gòu),剪碎后加入 10倍于其體積的4℃預(yù)冷的腦組織裂解液 (每毫升含 PMSF6μl,現(xiàn)用現(xiàn)加),靜置 30min后勻漿離心 (4℃,13000r/min,30min),取上清液。采用 Bradford法測(cè)定蛋白濃度,按體積比加上樣緩沖液,100℃煮 5min,等量上樣后進(jìn)行 SDS-PAGE電泳,5%濃縮膠中 (80V,0.01A),12%分離膠中 (120V,0.02 A),然后半干轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯 (PVDF)膜上 (50V,2 h),5%脫脂奶粉室溫封閉 2h,分別加兔抗大鼠 BDNF(1∶800),抗 GAPDH抗體 (1∶1000)4℃孵育過(guò)夜,濃縮型辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗 (1∶1000)37℃孵育 2h。入 MF-ChemiBIS3.2(DNRBio-ImagingSystem)成像儀。成像后以 Scionimage軟件 (ScionCorporation)測(cè)量目的條帶的光密度值,并將各條帶的光密度值以相應(yīng) GAPDH條帶的光密度值進(jìn)行校正。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以 (x±s)表示,應(yīng)用 SPSS 11.5軟件單因素方差分析進(jìn)行組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

3組大鼠海馬腦神經(jīng)元中 BDNF的免疫印跡結(jié)果如圖 1所示,在相對(duì)分子量為13kD處有一清晰的 BDNF條帶,Western blotting成像后以 Scionimage軟件 (ScionCorporation)測(cè)量目的條帶的光密度值,并將各條帶的光密度值以相應(yīng) GAPDH條帶的光密度值進(jìn)行校正。光密度值比值統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,3組大鼠 BDNF表達(dá)水平間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=10.834,P=0.001),模型組 BDNF的表達(dá)水平弱于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.000),而干預(yù)組 BDNF表達(dá)水平較模型組上調(diào),與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.019,見表 1)。

表 1 3組大鼠海馬 BDNF表達(dá)水平 (x±s)Table1 TheexpressionlevelsofBDNFweredigitizedbyusingScionimage softwareandstandardizedbyGAPDH

圖 1 大鼠海馬 BDNF的表達(dá) (免疫印跡法)Figure1 TheexpressionofBDNFwasdeterminedbywesternblottinganalysis

3 討論

本研究通過(guò)免疫組化和免疫印跡的方法發(fā)現(xiàn)大鼠側(cè)腦室注射 Aβ25-35后能誘導(dǎo) BDNF水平的下降,與 Christensen等[10-11]的研究結(jié)果相似,提示可能在 AD時(shí)產(chǎn)生的 Aβ能誘導(dǎo)BDNF水平的下降,從而加重了 AD神經(jīng)元的損傷,使其記憶認(rèn)知功能發(fā)生障礙。因此抑制 AD患者腦內(nèi) BDNF水平的下降可能對(duì) AD有一定的改善作用。一些研究表明 Aβ25-35同時(shí)能降低 BDNF功能的發(fā)揮,如 Tong等[12]的研究表明較低劑量的 Aβ就能降低 BDNF的功能,具體機(jī)制為主要抑制了 BDNF發(fā)揮作用的兩條通路:有絲分裂蛋白激活酶 (ras-mitogenactivated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路中的細(xì)胞外信號(hào)激酶 (extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)信號(hào)通路和磷脂酰肌醇 3磷酸酶 (phosphatidylinositol3-kinase,PI-3-K/AKT)信號(hào)通路。故在 AD情況下,BDNF功能的下降可能也加重了學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙及神經(jīng)損傷,其可能也是我們將來(lái)的一個(gè)研究方向。

本研究通過(guò)免疫組化及免疫印跡法顯示 DN能增加 AD模型大鼠腦內(nèi) BDNF的表達(dá)。一些研究顯示其對(duì)正常大鼠大腦內(nèi)BDNF的影響較小[13]。故推測(cè)作用機(jī)制可能與其能抑制 Aβ的作用有關(guān)。與國(guó)外的一些結(jié)果類似,如 Leyhe等[14]的研究表明口服 DN組患者與服安慰劑者相比血清中 BDNF水平顯著增加,推測(cè) DN通過(guò)增加 AD患者 BDNF的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Kotani等[15]的研究顯示 DN可增加 DG區(qū)磷酸化 cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白 (Phosphorylation cAMPresponse elementbinding protein,pCREB)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),故推測(cè)其可能激活cAMP反應(yīng)元件而上調(diào) BDNF的表達(dá)。其對(duì)其他調(diào)節(jié)元件的作用仍不清楚。另外其能否通過(guò)增加膽堿量而增加 BDNF的研究結(jié)果也很不一致,仍有待進(jìn)一步研究。

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