黃趙剛， 高 建，2，3*， 李 萍， 高 雷， 朱冬春， 夏 泉， 許杜娟，3

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥化學(xué)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230022;2.中國(guó)藥科大學(xué)“現(xiàn)代中藥”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210009;3.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，抗炎免疫藥理學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230032)

當(dāng)歸補(bǔ)血湯系中醫(yī)經(jīng)典名方，始載于李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論》，按黃芪-當(dāng)歸為5∶1組成，具補(bǔ)氣生血、扶正固本等功效，臨床上用于多種疾病的治療。現(xiàn)代藥理研究表明［1-4］:當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有促進(jìn)造血、調(diào)節(jié)免疫功能、保護(hù)心腦血管、抗纖維化、對(duì)化療藥具增效減毒等作用。當(dāng)歸補(bǔ)血總苷是當(dāng)歸補(bǔ)血湯皂苷類總成分，為其主要活性部位之一，本文建立了當(dāng)歸補(bǔ)血總苷的HPLC指紋圖譜，意在加強(qiáng)其質(zhì)量控制。

1 儀器及試藥

1.1 儀器 A gilent 1100高效液相色譜儀(ALS自動(dòng)進(jìn)樣器，四元泵)，DAD檢測(cè)器，分析天平(Mettler Toledo AG285)。

1.2 試藥 乙 腈(HPLC級(jí)，CALEDON公司)，水為純化水。黃芪、當(dāng)歸藥材均由本院中藥庫(kù)提供，購(gòu)自南京醫(yī)藥合肥天星有限公司，經(jīng)鑒定黃芪為膜莢黃芪Astragalus membraceus(Fisch)Bge.，當(dāng)歸為 A ngelica sinesia(Oliv.)Diels 。

2 方法結(jié)果

2.1 色譜條件 色 譜柱:Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水梯度洗脫，梯度程序(乙腈):0 ～7 min 8%，15 min 20%，30 min 30%，45 min 60%，50～55 min 100%;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm;柱溫:30℃ 。

2.2 供試品溶液的制備 取 黃芪、當(dāng)歸藥材粗粉，稱取黃芪、當(dāng)歸12.0 g(5∶1)，加10倍75%乙醇回流提取2次，合并醇提液趁熱過(guò)濾，減壓濃縮回收乙醇;濃縮物加適量蒸餾水溶解，水飽和正丁醇(1∶1)萃取3次，合并正丁醇萃取液，回收正丁醇后得粗總苷;粗總苷用大孔吸附樹(shù)脂吸附，分別以蒸餾水，40%乙醇和70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，蒸干，加流動(dòng)相(乙腈-水=50∶50)溶解并定容至10 mL，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾即得。

2.3 對(duì)照溶液的制備 分 別取黃芪藥材粗粉10.0 g、當(dāng)歸藥材粗粉2.0 g，按2.2項(xiàng)下操作，得黃芪、當(dāng)歸單味藥材對(duì)照液。

2.4 精密度試驗(yàn) 取 同一份供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，按2.1項(xiàng)條件分析，結(jié)果各峰保留時(shí)間的RSD小于1%，峰面積的RSD小于3%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取 同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣10 μL，按2.1項(xiàng)條件分析，結(jié)果各峰保留時(shí)間的RSD小于2%，峰面積的RSD小于3%，說(shuō)明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取 同一批次黃芪、當(dāng)歸按2.2項(xiàng)下操作，一式5份，按2.1項(xiàng)條件進(jìn)樣10 μL，HPLC 分析，結(jié)果各峰保留時(shí)間RSD的小于2%，相對(duì)峰面積的RSD小于3%，以第1份為參比，其余各份的相似度大于0.971。說(shuō)明重復(fù)性較好。

2.7 樣品分析 分 別取不同批次供試品溶液、不同批次對(duì)照溶液，按2.1項(xiàng)條件進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1，表1，表2。

圖1 當(dāng)歸補(bǔ)血總苷、當(dāng)歸提取物和黃芪提取物HPLC圖譜

表1 10批次當(dāng)歸補(bǔ)血總苷相對(duì)保留時(shí)間

表2 10批次當(dāng)歸補(bǔ)血總苷相對(duì)峰面積

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

通過(guò)對(duì)10個(gè)不同批次當(dāng)歸補(bǔ)血總苷的HPLC分析，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”軟件進(jìn)行指紋峰的分析，多點(diǎn)校正后進(jìn)行自動(dòng)匹配，確定了13個(gè)共有峰。10批樣品共有峰面積占總峰面積百分比分別為:90.7、92.4、94.5、94.2、95.2、95.4、92.9、90.9、92.2、93.8;主要共有峰面積百分比見(jiàn)表3。經(jīng)與單味藥材HPLC圖譜比較，其中1、3、5號(hào)峰為當(dāng)歸和黃芪單味藥材提取物共有，13號(hào)峰歸屬當(dāng)歸，其余號(hào)峰歸屬黃芪。分析結(jié)果顯示:13個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的重現(xiàn)性較好，RSD分別為0.2% ～1.0%1.6% ～4.6%，表明本法重現(xiàn)性較好，10 個(gè)批次當(dāng)歸補(bǔ)血總苷的質(zhì)量基本一致。

表3 主要共有峰面積占總峰面積百分比/%

將10批樣品供試品溶液色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件，自動(dòng)匹配后生成對(duì)照?qǐng)D譜，以此作為當(dāng)歸補(bǔ)血總苷的對(duì)照指紋圖譜，進(jìn)行相似性評(píng)價(jià)。結(jié)果10 批樣品的相似度分別為:0.921、0.937、0.955、0.948、0.959、0.967、0.938、0.932、0.934、0.942;10 批樣品的相似度均大于0.9，說(shuō)明以上述當(dāng)歸補(bǔ)血總苷制備工藝制備的樣品一致性較好。

3.2 討論

在HPLC指紋圖譜流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇中，分別對(duì)乙腈-水系統(tǒng)［5］、甲醇-水系統(tǒng)［6］進(jìn)行考察，結(jié)果表明，乙腈-水系統(tǒng)分離效果較好，各峰的分離度良好，基線穩(wěn)定，有利于指紋圖譜的分析，因此采用乙腈-水梯度洗脫系統(tǒng)。由于當(dāng)歸補(bǔ)血總苷無(wú)明顯特征紫外吸收，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm(末端吸收)。7號(hào)色譜峰相對(duì)分離較好，附近無(wú)其他峰干擾，峰面積適中，因此選擇7號(hào)峰作為參比峰。

中藥指紋圖譜能夠基本反映中藥的整體宏觀特征，可以從整體上準(zhǔn)確、量化地對(duì)中藥進(jìn)行真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評(píng)價(jià)。計(jì)算并評(píng)定各個(gè)批次中藥材產(chǎn)品的指紋圖譜間的整體相似程度，根據(jù)整體相似程度來(lái)估算它們各自化學(xué)組成的整體波動(dòng)程度，可以為有效控制中藥材產(chǎn)品的質(zhì)量提供科學(xué)可靠的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)研究不同批次制備的當(dāng)歸補(bǔ)血總苷樣品的指紋圖譜，實(shí)驗(yàn)的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性較好，指紋圖譜的穩(wěn)定性較好，能有效體現(xiàn)出對(duì)當(dāng)歸補(bǔ)血總苷鑒別的特征性和專屬性，符合指紋圖譜的要求，可用于當(dāng)歸補(bǔ)血總苷的質(zhì)量控制。

［1］范 穎，陳信義.當(dāng)歸補(bǔ)血湯的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24(9):1643-1645.

［2］馬文靜，孫 璐，孫 娟，等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯及當(dāng)歸黃芪提取部位組合物對(duì)P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2009，7(7):807-808.

［3］陳 園，陶艷艷，劉成海.當(dāng)歸補(bǔ)血湯及其單味藥抗肝纖維化研究進(jìn)展［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2008，42(5):92-94.

［4］陳鵲汀，劉智勤，朱惠學(xué)，等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯聯(lián)合環(huán)磷酰胺抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30(16):1568-1571.

［5］劉東輝，黃水清，黃月純，等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯皂苷類成分HPLC指紋圖譜研究［J］.中藥材，2006，29(8):844-846.

［6］王慶敏，李曉寧，王 兵，等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯有效部位指紋圖譜歸屬分析［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19(11):2658-2660.