鄭 琴， 郝偉偉， 樂志艷， 陸浩偉， 盧燕香， 楊 明

(江西中醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330004)

制川烏與白芍均具有鎮(zhèn)痛、抗炎作用。制川烏發(fā)揮藥效的主要成分為其所含的生物堿類物質(zhì)，白芍中主要化學(xué)成分芍藥苷。微波提取技術(shù)具有快速、溶劑用量少、提取率高、成本低等許多優(yōu)點(diǎn)，是一種天然產(chǎn)物提取的新技術(shù)［1-3］。本實(shí)驗(yàn)以烏頭總生物堿、芍藥苷為指標(biāo)，用紫外可見分光光度法、高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝，將微波提取法用于制川烏與白芍配伍后烏頭總堿及芍藥苷的提取，通過比較傳統(tǒng)提取法與微波提取法對(duì)有效成分煎出量的影響，為微波提取應(yīng)用于中藥有效成分的提取可行性提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HWC-3LA型微波提取設(shè)備(廣州興興微波能設(shè)備有限公司);agilent 1200液相色譜儀(美國)，包括:四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、G1314B VWD紫外檢測(cè)器;UV-2550型紫外可見-分光光度計(jì)(日本島津公司);Sartorius BS124S電子分析天平。

1.2 試藥 制川烏藥材(購自江油恒源藥業(yè)集團(tuán)有限公司，產(chǎn)地:四川，批號(hào):20080930)，白芍藥材(購自黃慶仁大藥房，產(chǎn)地:浙江，批號(hào):20080925)，由中藥鑒定教研室鑒定符合《中國藥典》2005年版。對(duì)照品:烏頭堿(購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):110720-200410)，芍藥苷(購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):110736-200629)，乙腈(色譜純，德國MOKER公司)，雙蒸水(自制)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 烏頭總生物堿的含量測(cè)定方法［4］

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取烏頭堿對(duì)照品適量，置25 mL量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸溶液，并添加至刻度，搖勻，即得0.149 mg/mL的烏頭堿對(duì)照品溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取 0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mL 烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別置分液漏斗中，各依次加入0.01 mol/L鹽酸溶液 2.00、1.75、1.50、1.25、1.00、0.50、0.00 mL，各精密加醋酸-醋酸鈉緩沖液10 mL，溴甲酚綠液2 mL，氯仿10 mL，振搖3 min，靜置，分取氯仿層，照分光光度度法(附錄V)在416 nm波長處測(cè)定吸光度。以濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，得回歸方程:A=0.6678 C+0.115，r=0.9998，烏頭堿在0.037～0.298 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 供試品溶液的制備 按處方比例稱取40目制川烏、白芍藥材粉末，加適量溶劑，分別進(jìn)行微波和回流提取，提取液離心過濾，精密吸取10 mL，低溫蒸干，殘?jiān)?0 mL蒸餾水溶解，加氨試液調(diào)節(jié)pH值10～11，用氯仿萃取4次，每次10 mL，合并氯仿液，蒸干，殘?jiān)?.01 mol/L鹽酸溶液，分次溶解，并轉(zhuǎn)入25 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。

精密量取供試品溶液與空白溶液各2 mL，分別置分液漏斗中，照2.1.2項(xiàng)下方法，自“各精密加醋酸-醋酸鈉緩沖液10 mL”起，依法測(cè)定吸收度，計(jì)算，即得。

2.1.4 烏頭總生物堿收率的計(jì)算 按照《中國藥典》2005年版一部制川烏項(xiàng)下的方法測(cè)得制川烏藥材中烏頭總生物堿以烏頭堿計(jì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.45%。

烏頭總生物堿的收率=提取液中烏頭總生物堿的質(zhì)量/制川烏藥材中總生物堿的質(zhì)量×100%

M0為提取液中烏頭總生物堿的質(zhì)量;M1、M2分別為制川烏和白芍的生藥材量。

2.2 芍藥苷的含量測(cè)定方法

2.2.1 色譜條件 十八烷基鍵合硅膠柱Hypersil ODS 2 C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸水(15∶85);柱溫:30℃;檢測(cè)波長:230 nm;流速:1.0 mL/min。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，用50%甲醇溶解，配制40.80 μg/mL的芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品母液。分別準(zhǔn)確吸取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的對(duì)照品母液，置 1 mL 棕色量瓶中，用50%甲醇溶液定容至刻度，制得6個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液。取上述濃度對(duì)照品溶液，按2.1.2項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL分析。以芍藥苷的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)X，平均峰面積(A)為縱坐標(biāo)Y，得回歸方程 Y=25.924X-3.2414，r=0.9995，結(jié)果表明芍藥苷在0.408～40.8 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 供試品溶液的制備 按處方比例稱取40目制川烏、白芍藥材粉末，加適量溶劑，分別進(jìn)行微波和回流提取，提取液離心過濾，精密吸取1 mL置于10 mL量瓶中，用65%乙醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.2.4 測(cè)定 精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算芍藥苷的質(zhì)量濃度。

2.2.5 芍藥苷收率的計(jì)算 按照《中國藥典》2005年版一部芍藥苷項(xiàng)下的方法測(cè)得白芍藥材中芍藥苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為1.63%。

芍藥苷的收率=提取液中芍藥苷的質(zhì)量/白芍藥材中芍藥苷的質(zhì)量×100%

M0為提取液中芍藥苷的質(zhì)量;M1、M2分別為制川烏和白芍的生藥材量。

2.3 浸膏得率的測(cè)定

精密量取提取液10 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，按下式計(jì)算浸膏得率。

W為10 mL藥液的浸膏重量;V為提取液的體積;W0為藥材重量。

2.4 制川烏白芍微波提取

2.4.1 實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì) 分別選擇微波功率、提取時(shí)間、提取溶劑濃度、溶劑用量作為四因素，進(jìn)行三水平實(shí)驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 因素水平

2.4.2 微波提取的正交實(shí)驗(yàn) 按表2 L9(3)正交表設(shè)計(jì)的順序進(jìn)行微波提取。每份樣品提取兩次，合并提取液。精密量取適量提取液，照2.1～2.3項(xiàng)下烏頭總生物堿、芍藥苷及浸膏得率進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表2。方差分析結(jié)果見表3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，直觀分析:影響烏頭總生物堿含量的各因素作用的主次為A＞D＞C＞B，影響芍藥苷含量的各因素次序?yàn)?C＞B=A＞D，影響浸膏得率各因素次序?yàn)?C＞D＞A＞B;方差分析可見:對(duì)烏頭總生物堿為指標(biāo)性成分影響因素A、D存在顯著性差異，對(duì)芍藥苷及浸膏得率各因素不存在顯著性影響，綜上所述:確定提取工藝為A3B2C2D3:提取功率為:800 W，提取時(shí)間為:30 min，提取溶劑:65%乙醇，溶劑用量為10倍量。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果

表3 方差分析

(續(xù)表3)

2.5 制川烏白芍回流提取

2.5.1 實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì) 分別以提取時(shí)間、溶劑濃度、溶劑用量、提取次數(shù)作為四因素，進(jìn)行三水平實(shí)驗(yàn)，因素水平表見表4。

表4 因素水平

2.5.2 傳統(tǒng)回流提取的正交實(shí)驗(yàn) 按表5L9(3)正交表設(shè)計(jì)的順序進(jìn)行回流提取。精密量取適量提取液，照2.1～2.3項(xiàng)下烏頭總生物堿、芍藥苷及浸膏得率進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表5。方差分析結(jié)果見表6。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，直觀分析:影響烏頭總生物堿含量的各因素作用的主次為C＞D＞B＞A;影響芍藥苷含量的各因素次序?yàn)?D＞A＞B＞C;影響浸膏得率各因素次序?yàn)?D＞B＞A＞C;方差分析可見:因素C、D對(duì)烏頭類生物堿有顯著性影響，而對(duì)其他指標(biāo)性成分影響不顯著。實(shí)驗(yàn)同時(shí)考慮到與微波提取工藝的可比性，確定最佳工藝為:A3B2C3D2，即提取時(shí)間:2 h，溶劑濃度:65%乙醇，溶劑用量10倍量，提取次數(shù)2次。

表5 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果

表6 方差分析表

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按比例稱取制川烏、白芍藥材，分別按微波提取和傳統(tǒng)回流提取的最佳提取條件提取，測(cè)定。結(jié)果見表7。

表7 工藝的驗(yàn)證及提取率比較

從表7可以看出，與傳統(tǒng)提取方法相比，微波提取所需時(shí)間縮短7倍、溶劑的用量減少了1倍，烏頭總生物堿的轉(zhuǎn)移率為0.94倍，芍藥苷的轉(zhuǎn)移率提高到1.68 倍。

3 討論

通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化得到微波與傳統(tǒng)提取制川烏配伍白芍的工藝條件，并經(jīng)驗(yàn)證得出烏頭總生物堿微波提取法的平均收率為80.31%，傳統(tǒng)回流提取法為 85.13%;微波提取法芍藥苷平均收率為45.51%，傳統(tǒng)回流提取法為26.94%。試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)烏頭總生物堿而言，微波提取略比傳統(tǒng)回流方法的提取率低，但微波提取法芍藥苷的轉(zhuǎn)移率是傳統(tǒng)提取法的1.68倍，且微波提取法與傳統(tǒng)的熱回流法相比，大大縮短了提取的時(shí)間，節(jié)省了提取溶劑的用量，從而減低了生產(chǎn)成本。芍藥苷對(duì)光、熱不穩(wěn)定，傳統(tǒng)的熱回流提取工藝，傳熱速度慢，易造成芍藥苷在加熱過程中慢慢分解。微波提取法具有快速提取的優(yōu)點(diǎn)，減少了提取物在高溫下的受熱時(shí)間，從而有利于減少芍藥苷類物質(zhì)的分解。

微波提取技術(shù)已應(yīng)用于生物堿類、蒽醌類、黃酮類、皂苷類、多糖、揮發(fā)油、色素等成分的提取。微波萃取技術(shù)作為一種新型的萃取技術(shù)，具有一定的適用范圍，如微波對(duì)物質(zhì)提取的選擇性，以及對(duì)溶劑要求等方面。Ganzler K［1］等研究表明用極性溶劑提取極性物質(zhì)，微波法比索氏等其他提取方法理想;但用非極性溶劑提取非極性物質(zhì)微波提取并未顯示優(yōu)越性。

［1］Ganzler K，Salgo A，Valkok.Microwave extraction-a novel sample preparation method for chromatography［J］.J Chromatogr，1986，(371):299-306.

［2］龔盛昭，楊卓如.微波萃取黃芩甙的協(xié)同效應(yīng)研究［J］.精細(xì)化工，2003，20(7):435.

［3］龔盛昭，程 江，楊卓如.微波場(chǎng)協(xié)同提取蘆丁［J］.精細(xì)化工，2003，20(12):758.

［4］王蘇會(huì).抗風(fēng)濕顆粒的制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［D］.北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)，2005.