孫建中， 張 懷， 賈天柱*， 張 希

(1.遼寧中醫(yī)藥大學，2.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116600;3.威海市中醫(yī)院，山東威海264200)

沙苑子為豆科植物扁莖黃芪Astragalus complanatus R.Br.的干燥成熟種子［1］。具有溫補肝腎、固精、縮尿、益肝明目的功能。沙苑子的炮制工藝具有悠久的歷史，鹽炙法是沙苑子最常用的炮制方法?，F(xiàn)代研究表明，本品所含化學成分主要有氨基酸、黃酮類、三萜類、脂肪酸以及微量元素等［2］。據(jù)有關(guān)文獻［3］記載，沙苑子苷A是沙苑子中主要的生物活性成分之一，具有保護肝細胞、抑制肝纖維化形成的作用;鼠李檸檬素對體外部分腫瘤細胞有直接抑制作用，而且都隨著濃度的增加，抑制作用增強［4］。目前還尚未見有同時測定沙苑子苷A和鼠李檸檬素的HPLC含量測定的報道。

本實驗以沙苑子苷A和鼠李檸檬素為對照品，建立了其含量測定方法，同時考察了沙苑子炮制前后沙苑子苷A和鼠李檸檬素的變化情況，為沙苑子的炮制研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 series高效液相色譜儀(包括G1314 VWD檢測器、G1379A真空脫氣機、G1311A四元泵);LG燒烤型微波爐［S/NO303TA722082，型號:WP700(MG-50037)，產(chǎn)品號:MG-5003TW，額定電壓:220 V-50 HZ，輸出功率:700W，微波輸出功率:1050W，燒烤輸出功率:950W，震蕩頻率:2450 MHZ］;METTLER AE240型十萬分之一分析天平(瑞士METTLER);FA1004B電子天平(上海精密科學儀器有限公司);101型電熱鼓風干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);乙腈為色譜純，水為超純水。

沙苑子苷 A［5］、鼠李檸檬素對照品(自制，HPLC檢測純度＞99.0%，歸一化法);沙苑子購于安徽瀘譙中藥飲片廠，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學藥學院鑒定教研室翟延君教授鑒定為豆科植物扁莖黃芪(Astragalus complanatus R.Br.)的干燥成熟種子。

2 溶液制備

2.1 沙苑子及鹽沙苑子的炮制 經(jīng)初步篩選，確定沙苑子及鹽沙苑子炮制工藝如下:

A生品:取凈沙苑子50 g，粉碎，過60目篩，備用。

B清炒品:取凈沙苑子50 g，置炒鍋中，鍋底溫度120～130℃，炒制60 s，放涼，粉碎，過60目篩，備用。

C清水悶潤炒干品:取凈沙苑子50 g，加入20 mL清水至密閉容器內(nèi)，悶潤2 h，置炒鍋中，鍋底溫度120～130℃，炒制60 s，放涼，粉碎，過60目篩，備用。

D鹽水悶潤炒干品:取凈沙苑子50 g，加入20 mL鹽水(含2%鹽)至密閉容器內(nèi)，悶潤2 h，置炒鍋中，鍋底溫度120～130℃，炒制60 s，放涼，粉碎，過60目篩，備用。

E鹽水悶潤烘干品:取凈沙苑子50 g，加入20 mL鹽水(含2%鹽)至密閉容器內(nèi)，悶潤2 h，置于烘箱內(nèi)，溫度為60℃，烘干，4 h后取出，放涼，粉碎，過60目篩，備用。

F鹽水悶潤蒸后烘干品:取凈沙苑子50 g，加入20 mL鹽水(含2%鹽)至密閉容器內(nèi)，悶潤2 h，取出，置于蒸鍋中，圓氣后蒸60 min后取出，置于烘箱內(nèi)，溫度為60℃，烘干，4 h后取出，放涼，粉碎，過60目篩，備用。

G鹽水悶潤蒸后炒干品:取凈沙苑子50 g，加入20 mL鹽水(含2%鹽)至密閉容器內(nèi)，悶潤2 h，取出，置于蒸鍋中，圓氣后蒸60 min后取出，置于炒鍋內(nèi)，在鍋底溫度120～130℃下炒制60 s后取出，放涼，粉碎，過60目篩，備用。

H鹽水悶潤后微波品:取凈沙苑子50 g，加入20 mL鹽水(含2%鹽)至密閉容器內(nèi)，悶潤2 h，取藥置于微波爐內(nèi)，高火微波6 min后取出，放涼，粉碎，過60目篩，備用。

2.2 對照品溶液的制備 取沙苑子苷A對照品0.00395 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，從中精密量取1 mL置于50 mL量瓶中配制成每 1 mL 含沙苑子苷 A0.0079 mg［4］的對照品溶液;另精密稱取鼠李檸檬素對照品0.00413 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，從中精密量取1 mL置于50 mL量瓶中配制成每1 mL含鼠李檸檬素0.00826 mg的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備［4］取上述沙苑子生品及炮制品1 g，精密稱定，置50 mL三角瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)25 mL，密塞，超聲30 min，靜置，濾過，濾紙不棄;同法再次精密加入石油醚(60～90℃)25 mL，密塞，超聲30 min，靜置，用第一次的濾紙過濾，殘渣揮干石油醚;連同濾紙一起放入三角瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，密塞，稱重，超聲30 min，用60%乙醇補至原重，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱為 Agilent C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-0.2%磷酸溶液(采用梯度洗脫的方式:0～12 min，20% ～24%乙腈;12～40 min，24% ～70%乙腈);流速為1.0 mL/min，檢測波長為337 nm;沙苑子苷A和鼠李檸檬素的保留時間分別在10 min和30 min左右，且沙苑子苷A和鼠李檸檬素與相鄰成分色譜峰的分離度都在1.5以上，理論塔板數(shù)均大于4000。

分別精密吸取沙苑子苷A對照品溶液、鼠李檸檬素對照品溶液與供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，依上述色譜條件，測定，即得。HPLC圖見圖1。

4 線性關(guān)系考察

圖1 對照品(A)及沙苑子供試品(B)的HPLC圖

4.1 沙苑子苷A線性關(guān)系的考察 精密稱定沙苑子苷A對照品0.00395 g，置10 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，從中精密量取1 mL置于5 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度配制成0.0790 mg/mL沙苑子苷A 的對照品溶液，分別精密吸取 4、8、12、16、20 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件進行分析，測定峰面積，繪制標準曲線。結(jié)果表明沙苑子苷A在0.3160 ～1.580 μg呈線性關(guān)系，其回歸方程為 Y=112.14X+16.04，r=0.9999。

4.2 鼠李檸檬素線性關(guān)系的考察 精密稱定鼠李檸檬素對照品0.00413 g，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，從中精密量取1 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度配制成0.0413 mg/mL鼠李檸檬素的對照品溶液，分別精密吸取 4、8、12、16、20 μL 注入液相色譜儀，測定峰面積，繪制標準曲線。結(jié)果表明鼠李檸檬素在 0.1652 ～0.8260 μg呈線性關(guān)系，其回歸方程為 Y=99.005X-2.2，r=0.9997。

5 精密度試驗

精密吸取沙苑子苷A和鼠李檸檬素的對照品溶液各20 μL連續(xù)進樣6次，測定色譜峰面積。結(jié)果顯示沙苑子苷A和鼠李檸檬素的RSD分別為1.2%和 1.4%。

6 重復性試驗

精密稱取沙苑子粉末1 g(過60目篩)，共6份，按2.3項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取20 μL注入液相色譜儀，測定色譜峰面積。結(jié)果顯示沙苑子苷 A和鼠李檸檬素的 RSD分別為0.6%和1.5%，表明本試驗測定方法的重復性良好。

7 穩(wěn)定性試驗

精密稱取沙苑子粉末1 g(過60目篩)，按2.3項下方法制備供試品溶液，分別在 2、4、6、8、12 h 精密吸取20 μL注入液相色譜儀，測定色譜峰面積。結(jié)果顯示沙苑子苷A和鼠李檸檬素的RSD分別為0.9%和1.4%。實驗結(jié)果表明，在12 h內(nèi)供試品溶液化學性質(zhì)穩(wěn)定。

8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量(沙苑子苷A和鼠李檸檬素的含量分別為0.0967%，0.0340%)的同一沙苑子正品藥材10 g，6份，分別精密加入沙苑子苷A對照品溶液(精密稱取沙苑子苷A對照品11.00 mg，50%乙醇超聲溶解并定容至10 mL，即得)2 mL、鼠李檸檬素溶液(精密稱取鼠李檸檬素對照品12.00 mg，甲醇超聲溶解并定容至10 mL，即得)2 mL，按2.3項下方法制備溶液，進行測定。結(jié)果平均回收率分別為 99.61%、98.98%;RSD 分別為 0.58%、1.28%。表明本法準確度符合要求，見表1。

表1 沙苑子苷A、鼠李檸檬素回收率試驗結(jié)果(n=6)

9 樣品含量測定

取上述沙苑子生品及炮制品粉末各1 g，精密稱定，按上述色譜條件測定沙苑子苷A和鼠李檸檬素的含量，每個樣品皆平行測定3次，以外標一點法計算含量，其平均值和RSD，結(jié)果見表2。

表2 沙苑子的含量測定結(jié)果

10 討論

10.1 檢測波長的選擇 取沙苑子苷A對照品溶液和鼠李檸檬素對照品溶液進行紫外掃描，結(jié)果在266 nm及337 nm處均有最大吸收，但在337 nm波長下，干擾少，重現(xiàn)性好，故選擇337 nm作為檢測波長。

10.2 流動相的選擇 實驗過程中分別以乙腈-0.2%磷酸(20∶80)、乙腈-0.4%磷酸 (20∶80)、乙腈-0.2%磷酸(采用梯度洗脫的方式:0～12 min，20% ～24%乙腈;12～40 min，24% ～70%乙腈)為流動相進行了比較，結(jié)果以乙腈-0.2%磷酸(采用梯度洗脫的方式:0～12 min，20% ～24%乙腈;12～40 min，24% ～70%乙腈)為流動相所得峰形較好，分離度高，故選之。

10.3 方法的選擇 沙苑子種子中含油脂量高，需進行脫脂處理，試驗中篩選了石油醚(30～60℃)、石油醚(60～90℃)和乙醚3種試劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用石油醚(60～90℃)超聲處理既有良好的脫脂效果，又能保留目標成分。實驗過程中還對供試品溶液的其他提取方法進行了考察，最終確定了前述提取方法。

10.4 沙苑子苷A和鼠李檸檬素為苷和苷元的關(guān)系，沙苑子生品中沙苑子苷A的含量遠高于鼠李檸檬素的含量;炮制品中兩者的含量變化皆不大，其中鹽炙沙苑子中沙苑子苷A和鼠李檸檬素的含量最高，分析其原因主要為在炮制加熱過程中酶解沙苑子苷A的自生酶被破壞，即“殺酶保苷”原理。而此酶在何種條件下完全失效以保苷以及何種條件下此酶活性最強以利用其苷元的抗腫瘤的作用，有待進一步的研究。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:127.

［2］劉春宇，顧振綸.沙苑子的化學成分和藥理作用［J］.中國野生植物資源，2002，21(2):1.

［3］張建軍，閆興麗，張玉杰，等.HPLC測定沙苑子中沙苑子苷A的含量［J］.中國中藥雜志，2005，30(8):600.

［4］甄漢深，周燕園，袁葉飛，等.青天葵中黃酮類化合物的體外抗腫瘤實驗研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2008，14(3):36.

［5］Cui Baoliang，Nakamura M，Kinjo J.Chemical Constituents of Astragali Semen［J］.Chem Pharm Bull，1993，41(1):178.