張紅玉,楊 斌,何月秋

（1.貴州師范大學,貴州 貴陽550001；

2.西南林業(yè)大學云南省高校森林災害預警與控制重點實驗室,云南 昆明 650224；3.云南農業(yè)大學植物病理重點實驗室,云南 昆明 650201）

①紫莖澤蘭Eupatorium adenophorum英文俗名Crofton weed或Mistflower Eupatorium,是一種危害嚴重的世界性惡性雜草,與其他外來有害入侵植物一樣,對全球生物多樣性構成極大的威脅[1-2],并給我國農林畜牧業(yè)造成巨大的經濟損失[3-5]。該雜草不僅能分泌克生物質化感抑制周圍植物生長[6-7],而且其提取物具有抑菌活性[8-9],尤其對細菌和真菌的影響最大[10],因此許多病原微生物很難寄生在該雜草上,缺少自然控制因子是造成該雜草瘋狂入侵和蔓延的重要原因。鏈格孢菌Alternaria alternata、澤蘭尾孢Cercospora eupatorii等病原菌雖然能夠引起紫莖澤蘭葉斑病,但在大部分紫莖澤蘭發(fā)生區(qū),紫莖澤蘭病害的發(fā)生率并不高[11-13]。如何提高致病菌對該雜草的控制作用,是防除這類惡性雜草需要解決的重要問題。

目前人們研究紫莖澤蘭萃取物對病原真菌的影響,主要集中在對三七圓斑病Mycocentrospora acerina、葡萄炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、馬鈴薯晚疫病菌Phytophthora infestans、番茄灰霉菌Botrytis cinerea等病原真菌[8-10]的抑菌作用方面,而對紫莖澤蘭致病菌的影響尚未報道。紫莖澤蘭揮發(fā)性成分對其致病菌是否同樣存在抑菌作用,在松針褐斑病菌毒素脅迫下紫莖澤蘭揮發(fā)性成分是增強了抑菌作用,抑或有利于病原菌克服抑菌作用等問題尚不清楚,需要進一步的研究。試驗以分離自紫莖澤蘭罹病植株的2種致病菌（鏈格孢菌Alternariaalternata和擬盤多毛孢菌Pestalotiopsissp.）為供試菌株,研究了紫莖澤蘭新鮮葉片揮發(fā)性成分對供試菌株的影響,以及松針褐斑病菌毒素脅迫下誘導產生的揮發(fā)性成分對這2種致病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長的影響,探討松針褐斑病菌毒素的脅迫作用是否有利于提高致病菌對紫莖澤蘭的控制作用,以期為進一步探討能否利用毒素與紫莖澤蘭致病菌協(xié)同防除紫莖澤蘭提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 儀器水蒸汽蒸餾提取器、真空旋轉蒸發(fā)儀、氣質聯用儀（FINNIGAN TOP 8000/VOYAGER）。

1.2 供試材料

1）植物材料：供試用紫莖澤蘭采自西南林業(yè)大學校園及附近。

2）供試菌株：擬盤多毛孢、鏈格孢菌分離自云南省楚雄紫溪山罹病紫莖澤蘭葉片,保存于西南林業(yè)大學微生物室。松針褐斑病菌Lecanosticta acicola由西南林業(yè)大學微生物室提供,用于提取粗毒素。

1.3 試驗方法

1.3.1松針褐斑病菌粗毒素的制備 參照楊斌等[14]的方法提取獲得,用無菌水將毒素粗提物配制成2.5 mg/mL的溶液。

1.3.2紫莖澤蘭揮發(fā)油的提取

1）材料初處理：自無病蟲害的健康紫莖澤蘭植株取生長均勻一致的葉片,自來水沖洗后以濾紙吸干水分,待用。

①紫莖澤蘭新鮮葉片：稱取130 g,待用。

②毒素脅迫下紫莖澤蘭植株葉片：取一定量的紫莖澤蘭植株,插于2.5 mg/mL毒素粗提液中,48 h后,采下葉片,剪碎稱取130 g,待用。

2）紫莖澤蘭揮發(fā)油的蒸餾萃取：將經過初處理的2種材料分別用同時蒸餾萃取法進行揮發(fā)油的提取,萃取溶劑為石油醚,把材料放入蒸餾萃取裝置一端的500 mL圓底燒瓶中,用電熱套加熱；裝置的另一端為盛25 mL石油醚的100 mL圓底燒瓶,在60℃下水浴加熱[15],同時蒸餾萃取4 h,再蒸去石油醚,得到具有濃烈香味的淺黃色精油,收油率依次分別為0.20%和0.19%。將得到的揮發(fā)油進行GC-MS分析,分析測試條件為色譜柱：HP-5MS（60 m ×0.132 mm ×0.125 μ m）；載氣：He；流速：1 mL/min；進樣溫度：240℃；接口溫度：250℃；質譜掃描范圍：35～455 amu；離子源：EI源；電子能量：70 eV。

1.3.3揮發(fā)油對供試菌株影響的測定

1）供試菌種的培養(yǎng)：將擬盤多毛孢和鏈格孢菌的菌絲塊移植于PDA培養(yǎng)基上,置于22℃培養(yǎng)5～7 d,取一部分用無菌水輕輕將孢子洗下,搖勻,制成孢子懸浮液,濃度為105個/mL。另一部分用于菌絲生長試驗。

2）揮發(fā)油培養(yǎng)液制備：向PD培養(yǎng)液中加入少量的經過細菌過濾器過濾的精油,使體積分數分別為0.1%、0.5%和1%。以加入新鮮葉片揮發(fā)油的PD培養(yǎng)液為處理1,以加入毒素誘導揮發(fā)油PD培養(yǎng)液為處理2,以不含精油的PD培養(yǎng)液為對照。

3）生物活性測定：

①用懸滴法測定對孢子萌發(fā)的影響：在蓋玻片上加1滴不同體積分數的精油培養(yǎng)液,作為孢子萌發(fā)的培養(yǎng)液,將少量孢子懸浮液放在蓋玻片上的培養(yǎng)液中（懸滴液中孢子不宜太多）,將蓋玻片翻轉蓋在載玻片凹陷處（在載玻片凹陷四周涂一層凡士林,以防止水分蒸發(fā)）,然后將載玻片放在有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中,28℃恒溫箱中保濕培養(yǎng),12、24、36、48、60 h 后鏡檢孢子萌發(fā)數 。每一處理測定10組,試驗重復3次,結果取其平均值。孢子萌發(fā)標準為芽管長至超過孢子短徑的一半。孢子萌發(fā)率計算公式為：

②用干質量測定法測定菌絲生長量的變化：取不同體積分數的揮發(fā)油培養(yǎng)液各100 mL置于三角瓶中,接入少量病原菌菌絲,振蕩培養(yǎng)24、48、72、96 、120 h 后,搖勻,各倒出 10 mL 于有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中（濾紙連同培養(yǎng)皿已干燥）,放入80℃的恒溫箱中烘干（24 h）至恒質量,然后在天平上稱量再減去培養(yǎng)皿和干燥濾紙的質量,即得到每10 mL培養(yǎng)液所含菌絲的干質量,經換算,菌絲干質量的單位為mg/mL。每一處理測定10組,試驗重復3次,結果取其平均值。

1.3.4數據統(tǒng)計分析 采用SPSS軟件進行方差分析及顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 毒素脅迫離體/活體葉片揮發(fā)性成分的變化采用蒸餾萃取法進行紫莖澤蘭葉片揮發(fā)性成分的提取,并經GC-MS分析,結果表明,紫莖澤蘭新鮮葉片中有39個揮發(fā)性成分,相對含量較高的為α-紅沒藥醇（7.19%）、1,7,7-三甲基-二環(huán)庚-2-乙酸乙酯（4.85%）、八氫-7-甲基-3-亞甲基-4-（1-甲基乙基）-1H-環(huán)戊二烯-環(huán)丙基苯（2.98%）。毒素脅迫紫莖澤蘭植株活體葉片中有54個揮發(fā)性成分,主要成分為乙酸冰片酯（5.16%）、α-紅沒 藥醇（5.08%）、大 根香葉烯（3.68%）。說明松針褐斑病菌毒素脅迫可誘導紫莖澤蘭葉片產生更多揮發(fā)性物質,且揮發(fā)油主要成分及含量較非脅迫狀態(tài)明顯不同。

2.2 揮發(fā)油培養(yǎng)液對供試病原菌孢子萌發(fā)的影響與對照相比,紫莖澤蘭新鮮葉片揮發(fā)油對2種供試的紫莖澤蘭病原菌孢子萌發(fā)不僅沒有抑菌作用,相反,還能夠顯著地促進孢子萌發(fā)（P＜0.05）。培養(yǎng)60 h后,在新鮮葉片揮發(fā)油營養(yǎng)液中,擬盤多毛孢菌孢子萌發(fā)率為對照的1.7倍,鏈格孢菌孢子萌發(fā)率為對照的1～1.5倍。

與新鮮葉片相比,毒素誘導揮發(fā)油培養(yǎng)液對孢子萌發(fā)的促進作用更強（P＜0.05）。擬盤多毛孢菌在培養(yǎng)60 h后,處理2孢子萌發(fā)率最高可達59%,處理1為50%,對照為30%。鏈格孢菌孢子萌發(fā)率較擬盤多毛孢低,培養(yǎng)60 h后,處理1、處理2、對照孢子萌發(fā)率分別達20%、23%、13%（表1）?？梢?無論是紫莖澤蘭新鮮葉片還是毒素誘導揮發(fā)油均對2種供試菌的孢子萌發(fā)有非常顯著的促進作用（P＜0.01）,而且后者的促進作用更強。說明毒素脅迫所誘導產生的紫莖澤蘭揮發(fā)性成分十分有利于2種供試菌的孢子萌發(fā)。但隨著揮發(fā)油體積分數的增加,對孢子萌發(fā)的促進作用并未呈現成正增長趨勢。

2.3 揮發(fā)性成分營養(yǎng)液對供試病原菌菌絲生長的影響對于擬盤多毛孢而言,與對照相比,無論處理1還是處理2均對菌絲生長表現出抑制（P＜0.05）,且處理2抑制作用更強。培養(yǎng)72 h后,對照平均菌絲干質量可達3.21 mg/mL,而處理1中需培養(yǎng)96 h,在處理2中需培養(yǎng)120 h,菌絲干質量才能達到此值；培養(yǎng)120 h后,與對照相比,處理1和處理2對菌絲生長的抑制率均可達70%左右（表1）。

表1 揮發(fā)性成分對病原真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長的影響

試驗過程中發(fā)現,鏈格孢菌在PD培養(yǎng)液中菌絲生長十分緩慢,但揮發(fā)油能夠明顯促進菌絲生長。處理1和處理2僅培養(yǎng)24 h,平均菌絲干質量已分別為1.91～3.03、2.72～2.82 mg/mL,而對照培養(yǎng)120 h后的平均菌絲干質量僅為2.47 mg/mL（表1）。在揮發(fā)油營養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h時,菌絲生長驟增,處理1和處理2中菌絲干質量分別可達對照的 8.4倍、8.7倍；此后,隨著培養(yǎng)時間的增加,菌絲生長量增幅略微減弱,但培養(yǎng)120 h后,仍然分別可達對照的7.3倍、6.8倍?？梢?無論鮮葉揮發(fā)成分還是毒素誘導揮發(fā)成分均能極顯著地促進鏈格孢菌的菌絲生長（P＜0.01）,且后者促進作用更強。

3 討論

已往研究表明紫莖澤蘭揮發(fā)物有抑菌活性[10],本試驗通過GC-MS分析,表明松針褐斑病菌粗毒素脅迫可誘導紫莖澤蘭產生種類更豐富的揮發(fā)性成分,這些成分中的確不乏抑菌（或抑蟲）活性成分,如大根香葉烯對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有顯著的抑制作用[16],檸檬烯對很多細菌和真菌都具有較強的抗菌活性[17],乙酸冰片酯對馬鈴薯葉甲Leptinotarsa decemlineata具有較強的忌避作用等[18]。但本試驗研究結果也表明,毒素誘導產生的揮發(fā)性成分并沒有單純地僅表現出抑菌活性（如抑制擬盤多毛孢菌的菌絲生長）,相反,對紫莖澤蘭致病菌鏈格孢菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長,以及擬盤多毛孢的孢子萌發(fā),均表現出促進作用。換言之,毒素誘導產生的揮發(fā)性成分對不同的病原微生物,及其不同的生長階段（如孢子萌發(fā)階段或菌絲生長階段）的影響是不同的,不能簡單地劃定抑菌與否。更為有趣的是,這是致病菌本身經過長期與紫莖澤蘭協(xié)同進化而產生了適應能力的結果,還是毒素誘導產生的揮發(fā)性成分可能對某些病原微生物有抑制作用但對致病菌例外?一種可能的情況是,在毒素脅迫誘導紫莖澤蘭產生了大量的種類更豐富的揮發(fā)性成分,一方面,這些成分可能對某些病原微生物有抑制作用,但對致病菌起不到抑菌效果；另一方面則因此造成紫莖澤蘭自身物質的大量消耗,對致病菌的防御能力可能反而降低。從這個角度而言,松針褐斑病菌毒素脅迫可能有利于促進紫莖澤蘭感病。至少有一點是可以肯定的,毒素脅迫誘導紫莖澤蘭產生的揮發(fā)性成分不論是有利于致病菌的孢子萌發(fā),還是有利于其菌絲生長,最終都會影響到紫莖澤蘭病害的發(fā)生與發(fā)展。

當然,病害的發(fā)生發(fā)展是多因子共同作用的結果,單因子試驗不能完全模擬,松針褐斑病菌毒素脅迫對于紫莖澤蘭病害最終表現出促進還是抑制,還需要進一步通過接種試驗來驗證。在眾多的揮發(fā)性成分中,究竟是哪一種成分有利于紫莖澤蘭感病,也需要進一步深入研究。但如果僅從毒素-病原菌協(xié)同作用的角度來看,該毒素能夠與紫莖澤蘭致病菌（尤其是鏈格孢菌）協(xié)同作用,共同提高對紫莖澤蘭的除草效果。至于二者協(xié)同除控紫莖澤蘭的實際生防效果如何,仍需進行大量的實體接種試驗和田間防治試驗。

另外,由于松針褐斑病菌本身并不是紫莖澤蘭的致病菌,因此該菌產生的毒素與紫莖澤蘭病原菌協(xié)同作用,不僅可以增強紫莖澤蘭致病菌的生防效果,而且由于該毒素與紫莖澤蘭致病菌兩者對紫莖澤蘭的作用位點不同,較之致病菌與其自身分泌毒素的協(xié)同作用,能夠更有效地延緩或阻止紫莖澤蘭產生抗性生物型。

4 結論

綜上所述,受松針褐斑病菌毒素脅迫后,紫莖澤蘭揮發(fā)性成分對紫莖澤蘭致病菌鏈格孢菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長,以及擬盤多毛孢菌的孢子萌發(fā)有明顯的促進作用,這種促進作用強于紫莖澤蘭鮮葉揮發(fā)性成分；但誘導揮發(fā)性成分明顯抑制擬盤多毛孢菌的菌絲生長,且抑制作用超過鮮葉揮發(fā)性成分。從毒素—致病菌協(xié)同防除紫莖澤蘭的角度來看,該毒素脅迫有利于提高致病菌對紫莖澤蘭的控制作用。因此,研究結果可為利用毒素-致病菌共同作用,促紫莖澤蘭感病,為防除紫莖澤蘭提供理論基礎。

[1]Keane R M,Michael J C.Exotic plant invasions and the enemy release hypothesis[J].Trends in Ecology&Evolution,2002,17（4）：164-170.

[2]Lake J C,Michelle R L.Invasion success of exotic plants in natural ecosystems：the role of disturbance,plant attributes and freedom from herbivores[J].Biological Conservation,2004,117：215-226.

[3]強勝.世界性惡性雜草——紫莖澤蘭研究的歷史及現狀[J].武漢植物學研究,1998,16（4）：366-372.

[4]魯萍,桑衛(wèi)國,馬克平.外來入侵種紫莖澤蘭研究進展與展望[J].植物生態(tài)學報,2005,29（6）：1029-1037.

[5]尹俊.中國西南地區(qū)紫莖澤蘭防治的現狀及對策建議[J].草業(yè)科學,2006,23（6）：82-85.

[6]趙林,李保平,孟玲,等.不同氮、磷營養(yǎng)水平下紫莖澤蘭和多年生黑麥草苗期的相對競爭力[J].草業(yè)學報,2008,17（1）：145-149.

[7]鐘聲,段新慧,奎嘉祥.紫莖澤蘭對16種牧草發(fā)芽及幼苗生長的化感作用[J].草業(yè)學報,2007,16（6）：81-87.

[8]張培花,羅文富,楊艷麗.紫莖澤蘭汁液及其萃取物對馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用[J].西南農業(yè)學報,2006,19（2）：246-250.

[9]尹芳,張無敵,李麗,等.紫莖澤蘭汁液對植物病原菌的抑菌影響[J].安徽農學通報,2007,13（6）：132-133.

[10]田宇,侯婧,吳建平,等.紫莖澤蘭揮發(fā)性成分及抑菌活性研究[J].農藥學學報,2007,9（2）：137-142.

[11]郭光遠.國內新病害——紫莖澤蘭葉斑病病原菌的研究[J].植物病理學報,1991,21（4）：245-250.

[12]Wang F,Summerell B A,Marshall D R,et al.Biology and pathology of a species of Phaeoramularia causing a leaf spot of crofton weed[J].Australasian Plant Pathology,1997,26：165-172.

[13]陶永紅,李正躍,何月秋.昆明地區(qū)紫莖澤蘭葉斑病的發(fā)生規(guī)律[J].中國生物防治,2007,23（1）：37-41.

[14]楊斌,劉吉開,葉建仁,等.松針褐斑病菌毒素 LA-Ⅱ的分離純化及化學結構[J].南京林業(yè)大學學報（自然科學版）,2001,25（3）：21-25.

[15]吳田捷,楊光忠.紫莖澤蘭精油化學成分的GC/MS研究[J].華中師范大學學報（自然科學版）,1994,28（1）：87-90.

[16]張勁松,李博,陳家寬,等.加拿大一枝黃花揮發(fā)油成分及其抗菌活性[J].復旦學報（自然科學版）,2006,45（3）：412-416.

[17]Gupta S,ShuklaR,Prabhu K M,et al.Acute and chronic toxicity studies on partially purified hypoglycemic preparation from water extract of bark ofFicusbengalensis[J].Indian Journal of Clinical Biochemistry,2002,17（1）：58-63.

[18]Seheare W R.Components of oil of tansy that repel Colorade potato beetles（Leptinotarsa decemlineata）[J].Journal of Natural Products,2002,47：964-969.