張 濤 ，董子明，熊建榮，劉學(xué)進(jìn)

（1.河南省平頂山煤業(yè)集團(tuán)總醫(yī)院泌尿外科，河南平頂山 467000；2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，河南鄭州 450052）

人類線粒體DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）是由16569個堿基對組成的雙鏈閉環(huán)結(jié)構(gòu)，編碼與氧化磷酸化相關(guān)的2種rRNA、22 種 tRNA 和 13 種蛋白多肽基因[1]。nt16024～nt16569、nt1～nt575的非編碼區(qū)共有1120堿基對，稱為控制區(qū)（control region，D-loop），其中含有重鏈復(fù)制起點(diǎn)和啟動子等重要基因，調(diào)控mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[2]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞和衰老的組織細(xì)胞中，存在mtDNA的突變。因此，mtDNA尤其是D-loop的突變正逐漸成為腫瘤和老年病研究者關(guān)注的熱點(diǎn)[3]。本文旨在探討良性前列腺增生（BPH）細(xì)胞mtDNA控制區(qū)的突變及其意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

隨機(jī)選擇我院2004年5月～2005年2月行開放手術(shù)切除和電切除的BPH患者22例，年齡54～86歲，平均70歲；6例合并高血壓病、冠心病，2例合并糖尿病，2例合并肺結(jié)核。 切除的前列腺重 25～225 g，平均（63.0±40.2） g，均經(jīng)病理檢查證實(shí)為BPH。每個患者無菌條件下留取0.1 g BPH標(biāo)本1份于液氮中保存?zhèn)錂z。同時(shí)每個患者抽取靜脈血3 ml，分離出淋巴細(xì)胞于液氮中保存?zhèn)錂z。對照組為本地正常成年人10例，年齡 23～35歲，平均 28歲，前列腺重均＜20 g，病理檢查證實(shí)為正常前列腺。每人取0.1 g前列腺組織1份于液氮中保存?zhèn)錂z。

1.2 材料

引物：MT-DNA擴(kuò)增引物，參照GenBank J01415序列設(shè)計(jì) 2 對引物，MTP1：5'-CAT TAG CAC CCA AAG CTA AG-3'（15981～16000）；MTP2：5'-TAG GCT TTA TGA CCC TGA AG-3'（16530～16511），擴(kuò)增長度 550 bp；MTP3：5'-GCT AAA GTG AAC TGT ATC CG-3'（16477～16496）；MTP4：5'-TGG GGT GAT GTG AGC CCG TC-3'（622～641），擴(kuò)增長度734 bp；克隆鑒定引物，T7：5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA-3'；SP6：5'-CAT ACG ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3'，由生工公司合成，PAGE純化。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本DNA提取 組織塊取10～15 mg，外周血檸檬酸鹽抗凝，淋巴細(xì)胞分離液分離出白細(xì)胞，然后用Qiagen公司QIAamp DNA Micro kit提取MT-DNA，按照說明書操作。

1.3.2 MT-DNA PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增反應(yīng)體積為 30 μl，10× 緩沖液 3 μl，5 mmol/L 4× dNTP 2 μl、引物 MTP1、MTP2（或 MTP3和 MTP4）各 0.5 μl，Promega 公司高保真 Taq 酶 2 U，上步提取的 MT-DNA 5 μl，去離子水補(bǔ)足 30 μl。 94℃預(yù)變性 180 s，94℃變性 40 s，55℃復(fù)性 40 s，72℃延伸 50 s，擴(kuò)增 30 個循環(huán)。

1.3.3 電泳分析 取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，256 nm紫外燈下觀察結(jié)果，在550 bp和734 bp處出現(xiàn)條帶為MT-DNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物，照相。

1.3.4 MT-DNA與pGEM-T的重組 用膠回收試劑盒（德國Qiagen公司）回收M-DNA 550 bp和734 bp基因片段；回收的目的基因與pGEM-T連接，4℃過夜，轉(zhuǎn)化入JM109，藍(lán)白篩選得到陽性克?。╬GEM-T-MT1和pGEM-T-MT2）。

1.3.5 重組子的PCR鑒定 選取平板上生長的白色菌落為陽性菌落，轉(zhuǎn)種于 AMP+的 LB平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，取少量菌苔溶于去離子水 50 μl中，100℃水浴 10 min，10000 r/min離心5 min，取上清5 μl用克隆鑒定引物T7和SP6進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.6 DNA序列分析 對鑒定正確含有pGEM-T-MT1和pGEM-T-MT2的宿主菌培養(yǎng)擴(kuò)增，提取重組質(zhì)粒pGEM-T-MT1和pGEM-T-MT2，對插入序列進(jìn)行DNA測序，測得數(shù)據(jù)用DNASIS、OMIGA軟件進(jìn)行比對分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

組間比較用方差分析，突變堿基數(shù)與年齡和前列腺重量的關(guān)系用直線回歸t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增MT1和MT2電泳結(jié)果

預(yù)計(jì)MT1 PCR擴(kuò)增片段為550 bp，MT2 PCR擴(kuò)增片段為734 bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，MT1擴(kuò)增片段位于500 bp與750 bp之間，且接近500 bp MT2擴(kuò)增片段位于500 bp與750 bp之間，且接近750 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。見圖1、2。

2.2 重組克隆pGEM-T-MT1、pGEM-T-MT2的篩選與鑒定結(jié)果

由于pGEM-T多克隆位點(diǎn)兩側(cè)分別存在T7和SP6啟動子序列，因此可以用T7和SP6為引物對載體pGEM-T的多克隆位點(diǎn)是否插入外源基因序列進(jìn)行PCR篩選鑒定。因此，擴(kuò)增產(chǎn)物為550+170 bp和734+170 bp的即鑒定為正確重組的 pGEM-T-MT1和 pGEM-T-MT2。 見圖 3、4。

圖1 PCR擴(kuò)增MT1電泳結(jié)果Fig.1 Result of PCR amplification MT1 electrophoresis

圖2 PCR擴(kuò)增MT2電泳結(jié)果Fig.2 Result of PCR amplification MT2 electrophoresis

圖3 重組克隆pGEM-T-MT1鑒定結(jié)果Fig.3 Result of recombination clone pGEM-T-MT1

2.3 Mt-DNA序列分析結(jié)果

圖4 重組克隆pGEM-T-MT2鑒定結(jié)果Fig.4 Result of recombination clone pGEM-T-MT2

與劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列比較，22例BPH患者，個體的BPH細(xì)胞mtDNA 控制區(qū)變異的堿基對有 3～16 個[平均（7.36±3.70）個]，分布于52個位點(diǎn)上，這些變異分為兩種類型，第一種僅存在于BPH細(xì)胞的變異，即突變的堿基對有0～9個[平均（3.14±2.90）個]分布于27個位點(diǎn)上；第二種BPH細(xì)胞與淋巴細(xì)胞同樣變異的堿基對有 1～8 個[平均（4.23±1.69）個]分布于 27 個位點(diǎn)上。見表1。

表1 BPH線粒體DNA突變Tab.1 BPH mt DNA mutation

在22份BPH組織中，檢測到18份有mtDNA控制區(qū)突變，因此，BPH細(xì)胞mtDNA控制區(qū)的突變率是81%（18/22），突變頻率為2.4%（27/1120）。這些突變74%集中在第一高變區(qū)（HVⅠ）和第二高變區(qū)（HVⅡ），其中有11個位于微衛(wèi)星不穩(wěn)定區(qū)。突變方式多為點(diǎn)突變，包括轉(zhuǎn)換和顛換，2個位點(diǎn)是缺失。突變堿基數(shù)與患者年齡和增生前列腺重量均無相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）。由于人類mtDNA具有高度多態(tài)性，本研究選擇10份正常前列腺作為對照。10份正常前列腺細(xì)胞mtDNA控制區(qū)有 3～7 個[平均（4.60±1.49）個]堿基對變異，分布于 12 個位點(diǎn)上。見表2。

表2 10例正常前列腺mtDNA變異情況Tab.2 Polymophisms of 10 cases normal prostate mtDNA

正常前列腺細(xì)胞mtDNA控制區(qū)和BPH第二種類型變異的堿基對數(shù)和位點(diǎn)相近，兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明第二種類型變異是正常多態(tài)性，多態(tài)性類型與北京地區(qū)的報(bào)道相近[4]。

3 討論

線粒體是細(xì)胞的能量代謝場所，在進(jìn)行氧化磷酸化時(shí)產(chǎn)生大量的氧自由基，對缺乏組蛋白的保護(hù)、直接暴露于線粒體中的線粒體DNA有損傷作用，而線粒體DNA的損傷修復(fù)系統(tǒng)又不完善，因此表現(xiàn)出非常高的突變率，文獻(xiàn)報(bào)道線粒體DNA的突變率比核DNA高幾十倍，尤其在控制區(qū)，突變率更高[5]。近來研究發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤、癌前增生性病變和衰老組織中存在mtDNA的突變，F(xiàn)liss等[6]報(bào)道了一些腫瘤mtDNA控制區(qū)的突變率：膀胱癌28.6%、肺癌38.5%、卵巢癌32%和頭頸部腫瘤23%。值得注意的是，Junjian等[7]發(fā)現(xiàn)在前列腺癌和癌前病變上皮內(nèi)瘤（PIN）中mtDNA控制區(qū)突變率高達(dá)87.5%，突變頻率達(dá)3%。

筆者發(fā)現(xiàn)BPH細(xì)胞mtDNA控制區(qū)的突變率為81%，突變頻率為2.4%。大部分集中在HVⅠ和HVⅡ，突變類型多為點(diǎn)突變，包括轉(zhuǎn)換和顛換，2個位點(diǎn)是缺失，比較Junjian等[7]的研究結(jié)果后顯示BPH細(xì)胞mtDNA控制區(qū)的突變率和突變頻率均與前列腺癌相近。Junjian等[7]還發(fā)現(xiàn)，前列腺癌mtDNA控制區(qū)突變與患者的年齡和腫瘤的分級均沒有明顯關(guān)系，本研究也顯示BPH細(xì)胞mtDNA控制區(qū)突變與患者的年齡和前列腺增生的重量沒有相關(guān)性；而且也不波及外周血淋巴細(xì)胞。BPH細(xì)胞mtDNA控制區(qū)突變與腫瘤一樣都是以點(diǎn)突變?yōu)橹?，但與腫瘤的突變位點(diǎn)卻不一致。腫瘤細(xì)胞mtDNA在H鏈復(fù)制起點(diǎn)區(qū)域存在較多C→T突變，這種突變將降低該區(qū)的GC含量，導(dǎo)致mtDNA復(fù)制失控[8]。本研究結(jié)果顯示，BPH細(xì)胞mtDNA控制區(qū)這種突變很少，這可能解釋為什么BPH與惡性腫瘤的生物學(xué)行為不同；關(guān)于mtDNA突變的意義，有學(xué)者認(rèn)為只是隨機(jī)的改變，對疾病并無影響；但在腫瘤細(xì)胞，有學(xué)者研究認(rèn)為mtDNA突變的基因片段能夠游走并且整合到核基因組而誘發(fā)癌變[9-10]；而在衰老組織中，mtDNA突變的熱點(diǎn)是編碼區(qū)，該區(qū)往往存在長片段缺失。由于mtDNA編碼的都是與氧化磷酸化有關(guān)的RNA和蛋白多肽，當(dāng)缺失比率達(dá)到一定閾值后導(dǎo)致線粒體能量代謝和其他功能的異常而誘發(fā)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步引起組織器官功能減退[11-12]。BPH和腫瘤一樣細(xì)胞凋亡是減少的，由此看來，BPH的發(fā)病不是一個簡單的衰老過程，在mtDNA突變方面與腫瘤有某些相似之處。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BPH細(xì)胞mtDNA控制區(qū)存在較高的突變率和突變頻率，這些突變既不隨前列腺增大和增齡而積累，也不波及外周血淋巴細(xì)胞，其意義有待進(jìn)一步研究。

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