蔣燕鋒，斯金平，黃華宏，程龍軍

（浙江林學(xué)院 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安311300）

中藥材厚樸為木蘭科Magnoliaceae植物厚樸Magnolia officinalis或凹葉厚樸M.officinalis var.biloba的干燥干皮、枝皮和根皮［1］。前者主要分布于四川、湖北等省，稱為“川樸”，其葉型為小凸尖葉；后者主產(chǎn)于湖南、浙江、廣西、福建等省，稱為“溫樸”，其葉型為凹葉。兩者之間還有許多在葉形上呈中間狀態(tài)的過(guò)渡類型。厚樸是中國(guó)特有的常用中藥材，長(zhǎng)期以來(lái)主要利用野生資源。一方面因資源過(guò)度消耗，日益枯竭，另一方面因利用野生資源而導(dǎo)致品質(zhì)參差不齊，嚴(yán)重制約了厚樸藥材現(xiàn)代化國(guó)際化進(jìn)程。厚樸因其特殊的分類地位和資源的日益枯竭而先后被列為國(guó)家珍稀瀕危植物和二級(jí)保護(hù)中藥材。厚樸中藥材的質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)對(duì)保護(hù)和發(fā)展厚樸資源，滿足中藥現(xiàn)代化、產(chǎn)業(yè)化和國(guó)際化的要求尤為重要。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）是限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)的結(jié)合。AFLP標(biāo)記具有不需要預(yù)先知道基因組背景、多態(tài)位點(diǎn)豐富、靈敏度高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，克服了RFLP檢測(cè)位點(diǎn)有限和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）不穩(wěn)定等缺點(diǎn)［2］。AFLP問(wèn)世后便在樹(shù)木的數(shù)量性狀定位、種質(zhì)資源鑒定、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、群體遺傳結(jié)構(gòu)及多樣性研究、演化和親緣關(guān)系研究等方面得到了廣泛的應(yīng)用［3－8］，而對(duì)于厚樸來(lái)說(shuō)，目前僅有郭寶林等［9］利用 RAPD技術(shù)探討了厚樸種內(nèi)關(guān)系和道地性問(wèn)題。筆者以不同類型厚樸為試材，對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中影響AFLP分析的酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增及選擇性擴(kuò)增的各個(gè)環(huán)節(jié)依次進(jìn)行了優(yōu)化，最終建立了適合厚樸的較為理想的AFLP分析體系。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)已有厚樸研究，于9月下旬至10月上旬（厚樸種子成熟期）在湖北鶴峰、浙江景寧、廣西資源等3個(gè)分別代表小尖葉型、中間型及凹葉型的種源地種子，去掉外果皮后濕沙混藏。初春播種育苗于浙江林學(xué)院林木遺傳育種科研苗圃。

采集正常生長(zhǎng)的嫩葉，用冰壺帶回實(shí)驗(yàn)室，液氮速凍后置－70℃冰柜保存。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA的制備與檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）-硅珠吸附法［10］提取不同樣品的厚樸葉片DNA，用NanoDrop微量分光光度計(jì)（ND-1000）測(cè)定DNA的純度和濃度。同時(shí)每個(gè)樣品取5 μL，加1 μL上樣緩沖液混合后，于10.0 g·L－1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)（Gel DocTM，Bio-Rad）下觀察并照相。

1.2.2 DNA的酶切與連接 酶切反應(yīng)采用EcoR I和Mse I雙酶切組合，參考白樺Betula platyphylla基因組雙酶切體系［11］略作修改。厚樸的酶切體系為EcoR I（20×16.67 mkat·L－1，NEB）0.15 μL，Mse I（10×16.67 mkat·L－1，NEB）0.30 μL，10×NEB buffer 5.00 μL，100×牛血清蛋白（BSA）0.30 μL，加雙蒸水至 25.00 μL。模板DNA用量為100～700 ng，在 37℃ 水浴酶切 1～6 h后放入 75℃ 水浴15 min，使酶失活后，立即置于冰上冷卻。取 5.00 μL反應(yīng)液與 1.00 μL上樣緩沖液混合，于10.0 g·L－1瓊脂糖膠凝膠電泳檢測(cè)。連接體系 25.00 μL，含酶切產(chǎn)物 20.00 μL，T4 Ligase（400×16.67 mkat·L－1，NEB）0.10 μL，EcoR I 接頭（E 接頭，10.0 μmol·L－1）0.50 μL，Mse I接頭（M 接頭，10.0 μmol·L－1）1.00 μL，10×buffer 2.00 μL，雙蒸水 1.40 μL。16℃ 連接過(guò)夜。接頭序列如下：

1.2.3 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng) 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系：連接產(chǎn)物2.00 μL，Taq DNA聚合酶（5×16.67 mkat·L－1，NEB）0.20 μL，E ＋ A 引物（50 mg·L－1）1.00 μL，M ＋ C 引物（50 mg·L－1）1.00 μL，三磷酸脫氧核苷酸 dNTPs（2.5 mmol·L－1，TaKaRa）1.60 μL，10×PCR buffer 2.00 μL，加雙蒸水至 20.00 μL。預(yù)擴(kuò)增在 ABI9700 PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；最后 72℃ 延伸 5 min，4℃ 保持。取 5.00 μL預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物與 1.00 μL上樣緩沖液混合后于 15.0 g·L－1瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)預(yù)擴(kuò)增效果。

1.2.4 選擇性擴(kuò)增反應(yīng)及其優(yōu)化 選擇性擴(kuò)增的好壞直接關(guān)系銀染效果的好壞，因此，選擇擴(kuò)增的優(yōu)化至關(guān)重要。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋一定倍數(shù)后進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，選擇性堿基數(shù)為3。反應(yīng)體系為：稀釋后的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物 2.00 μL，Taq DNA 聚合酶（5×16.67 mkat·L－1，NEB）0.20 μL，E ＋ ANN 引物（20 mg·L－1）0.30 μL，M+CNN 引物（20 mg·L－1）1.80 μL，dNTPs（2.5 mmol·L－1，TaKaRa）1.60 μL，Mg2+（25.0 mmol·L－1）1.00 μL，10×PCR buffer 2.00 μL，加雙蒸水到20.00 μL。預(yù)擴(kuò)增在 ABI9700 PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 2 min；94℃30 s，65℃ 30 s（以后降低 0.7℃·循環(huán)-1），72℃1 min，13個(gè)循環(huán)；然后在退火溫度 56℃，其余條件不變的情況下，再進(jìn)行23循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保持。在此基礎(chǔ)上，我們從4個(gè)因素的多個(gè)水平進(jìn)行選擇性擴(kuò)增的優(yōu)化（表1），4個(gè)因素逐一優(yōu)化，且一個(gè)因素優(yōu)化后的結(jié)果在后續(xù)因素的優(yōu)化過(guò)程中固定下來(lái)。

1.2.5 PAGE電泳及銀染檢測(cè) 反應(yīng)結(jié)束后，選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液（體積分?jǐn)?shù)為98%甲酰胺；10.0 mmol·L－1乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0； 體積分?jǐn)?shù)為0.25% 溴酚藍(lán)； 體積分?jǐn)?shù)為0.25% 二甲苯青）等體積混合，95℃6 min后迅速將PCR管置于冰上以保持變性狀態(tài)，然后置于－20℃冰箱用于后續(xù)的電泳檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染的方法進(jìn)行檢測(cè)［12］。銀染后的板晾干后在膠片觀察燈下觀察，選擇那些具有清晰條帶的引物作為AFLP反應(yīng)的最佳引物。

表1 選擇性擴(kuò)增各因素處理方案Table 1 Different treatments of selective amplification factors

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取與檢測(cè)

CTAB-硅珠吸附法提取的厚樸葉片DNA經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶十分清晰明亮且無(wú)拖尾、背景干擾等現(xiàn)象（圖1），表明蛋白質(zhì)等雜質(zhì)去除較干凈，純度較高。經(jīng)測(cè)定，吸光度D260/D280比值在1.8左右，但質(zhì)量濃度相對(duì)較低，在90.0 mg·L－1左右。

圖1 CTAB硅珠法提取的DNA的瓊脂糖電泳圖Figure 1 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted by CTAB-SiO2method

2.2 AFLP反應(yīng)體系的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別用100～600 ng不同樣品的DNA進(jìn)行酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增，結(jié)果在15.0 g·L－1的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。以湖北五峰種源的厚樸為例（下同），擴(kuò)增條帶絕大部分為100～750 bp，且400 bp左右較為明亮（圖2）。最后經(jīng)60.0 g·L－1變性聚丙酰胺變性膠電泳，發(fā)現(xiàn)DNA濃度的不同沒(méi)有導(dǎo)致DNA條帶多寡的變化，而且條帶的清晰度也差別不大，因此考慮DNA使用量居中，為400 ng。

圖2 不同DNA用量對(duì)選擇性擴(kuò)增結(jié)果的影響Figure 2 Effect of different DNA treatments on selective amplification result

預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物的用量對(duì)選擇性擴(kuò)增結(jié)果有重要影響。實(shí)驗(yàn)中湖北五峰種源的厚樸DNA經(jīng)酶切、連接和預(yù)擴(kuò)后，預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物分別按1∶5，1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60進(jìn)行稀釋，選擇性擴(kuò)增后在15.0 g·L－1瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)稀釋倍數(shù)為20，30和40倍時(shí)，條帶較清楚且較明亮，在200～300 bp之間明亮度最高，片段擴(kuò)增量較多（圖3）。而30稀釋倍數(shù)是其中條帶清晰度和明亮度是最好的，故實(shí)驗(yàn)選用30稀釋倍數(shù)。

dNTPs，Mg2+和Taq DNA聚合酶是影響擴(kuò)增效果的關(guān)鍵因素。不同物種的AFLP分析中，dNTPs，Mg2+，Taq DNA聚合酶的最適濃度會(huì)有所不同。

體系中的dNTPs是PCR反應(yīng)的原料物質(zhì)，是反應(yīng)必不可少的組分之一。厚樸研究發(fā)現(xiàn)，體系中不同dNTP的濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果沒(méi)有顯著影響，但濃度增加可稍微提高擴(kuò)增產(chǎn)物的得率（圖4）。因此，綜合考慮試驗(yàn)成本和擴(kuò)增效率，選擇厚樸AFLP選擇性擴(kuò)增中 dNTP濃度為0.225 mmol·L－1。

圖3 不同稀釋倍數(shù)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的選擇性擴(kuò)增結(jié)果Figure 3 Different selective amplification results with different dilution multiple of pre-amplification products

圖4 不同dNTPs濃度對(duì)選擇性擴(kuò)增的影響Figure 4 Effect of dNTPs concentration on selective amplification result

Mg2+可以影響酶的活性、擴(kuò)增的真實(shí)性以及產(chǎn)物的特異性，故Mg2+濃度也是反應(yīng)中不可或缺的重要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，隨著Mg2+的濃度的增加，擴(kuò)增也越來(lái)越清晰。而當(dāng)Mg2+的濃度達(dá)到2.25 mmol·L-1時(shí)，出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增，Mg2+會(huì)與dNTP結(jié)合而影響擴(kuò)增效率（圖5）。因此，厚樸AFLP選擇性擴(kuò)增體系中Mg2+的濃度為2.00 mmol·L-1。

Taq DNA聚合酶在擴(kuò)增體系中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，聚合酶為8.34～33.34 nkat時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)較集中，且隨著酶的增加，集中的 PCR產(chǎn)物帶較清晰；41.68 nkat時(shí)可能酶的使用量過(guò)大而出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增（圖6）。綜合考慮，確定 20.00 μL反應(yīng)體系中Taq DNA聚合酶使用量為16.67 nkat。

圖5 不同Mg2+濃度對(duì)選擇性擴(kuò)增的影響Figure 5 Effect of Mg2+concentration on selective amplification result

圖6 不同Taq DNA聚合酶用量的選擇性擴(kuò)增結(jié)果Figure 6 Different treatments of Taq DNA enzyme on selective amplification result

2.3 厚樸AFLP優(yōu)化反應(yīng)體系的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)獲得的厚樸AFLP優(yōu)化體系的可靠性，我們對(duì)不同的厚樸樣品使用E-ACA+M-CAT引物對(duì)進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠泳檢測(cè)（圖7）。結(jié)果表明，不同樣品條帶清晰，說(shuō)明優(yōu)化的AFLP體系能產(chǎn)生較為理想的結(jié)果，這為AFLP技術(shù)體系在厚樸種質(zhì)資源鑒定、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、群體遺傳結(jié)構(gòu)及多樣性研究、演化和親緣關(guān)系研究等方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖7 不同樣品E-ACA+M-CAT引物選擇性擴(kuò)增電泳圖Figure 7 An electrophoretogram of different samples’selective amplification result with the primer E-ACA and M-CAT

因此，采用CTAB硅珠法提取的DNA質(zhì)量較好，適用于AFLP分析。酶切的基因組DNA以400 ng為宜，37℃條件下酶切時(shí)間為6 h較理想；預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋倍數(shù)以20倍為宜；20.00 μL選擴(kuò)反應(yīng)體系中 Mg2+濃度為2.00 mmol·L-1，dNTPs濃度為0.225 mmol·L-1，Taq DNA 聚合酶用量為16.67 nkat，擴(kuò)增帶清晰且穩(wěn)定，擴(kuò)增效果較理想，可以獲得清晰的AFLP指紋圖譜。

3 討論

AFLP技術(shù)程序多且復(fù)雜，從基因組DNA的提取到電泳銀染每個(gè)環(huán)節(jié)都必須嚴(yán)格要求，才能獲得最佳的結(jié)果。模板DNA的質(zhì)量和完全酶切是AFLP試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)證明，用CTAB-硅珠吸附法提取的厚樸DNA質(zhì)量符合AFLP技術(shù)要求。酶切時(shí)模板以400 ng為宜，酶切時(shí)間為6 h。預(yù)擴(kuò)增是一承上啟下的步驟，既可以檢測(cè)酶切和連接的效果，又可以對(duì)選擇性擴(kuò)增模板起到純化的作用。預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物的稀釋倍數(shù)對(duì)于選擇性擴(kuò)增的成敗非常重要，幾個(gè)稀釋梯度的瓊脂糖電泳譜帶差別不大，在垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳后稀釋30倍的電泳譜帶清晰，便于讀取，其他稀釋倍數(shù)下的擴(kuò)增條帶數(shù)目少、不清晰且擴(kuò)增結(jié)果不穩(wěn)定。Taq酶的價(jià)格比較高，摸索適當(dāng)?shù)拿赣昧?，?duì)試驗(yàn)效果及節(jié)約成本都大有益處。AFLP步驟多而且聯(lián)系密切，因此，建議在厚樸AFLP分析時(shí)，每完成一步，最好取少量樣品在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，得到預(yù)期效果后再進(jìn)行下一步試驗(yàn)。這樣既節(jié)省時(shí)間，又不浪費(fèi)試劑。

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