吳偉杰，李博生

(北京林業(yè)大學 生物科學與技術(shù)學院，北京 100083)

文冠果樹的適應性強，抗旱、耐瘠薄和耐寒能力強。在內(nèi)蒙古、遼寧、河北、山西、陜西等省均有栽種，是我國北方重要的木本油料樹種。文冠果種子含油率高達35% ～40%［1］，文冠果籽油是優(yōu)質(zhì)的食用油，也可作為生物柴油的原料。生物柴油作為清潔可再生能源，對經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展，推進能源替代，減輕環(huán)境壓力，減少碳排放，應對氣候變暖有著重要的戰(zhàn)略意義。文冠果果實的綜合利用是降低生物柴油生產(chǎn)成本的重要途徑之一。文冠果包括果皮和種子，兩者比例為1∶1。年產(chǎn)10萬t生物柴油，需要文冠果種子30萬 t，同時產(chǎn)生30萬 t果皮，而目前文冠果果皮主要用作活性炭原料，沒有得到有效地利用。文冠果果皮含有1.5%～2.4%的皂苷。研究表明，文冠果果皮皂苷具有良好的抗腫瘤活性、顯著改善多種記憶障礙、抗缺氧、抗氧化、抗疲勞等功效［2］。文冠果果皮皂苷的開發(fā)所產(chǎn)生的附加價值可以有效地降低生物柴油的生產(chǎn)成本。在生產(chǎn)生物柴油的過程中要處理極大量的果皮，就須尋求簡捷易行、高效率、環(huán)境友好的皂苷分離方法。

目前，皂苷的分離方法主要有萃取法和大孔樹脂吸附分離法。乙醇-正丁醇萃取分離工藝已經(jīng)應用于無患子皂苷的提取分離中［3］，但所需溶劑量大，純度低。采用大孔樹脂分離法純度較高，但周期長，溶劑耗量大，樹脂成本高［4］。

泡沫分離是一種成本低、工藝簡捷、環(huán)境友好、適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的分離方法。皂苷是一種天然的表面活性劑，無需另加表面活性劑［5］。泡沫分離法已廣泛用于人參皂苷、無患子皂苷、甘草等的分離，并考察了氣速、pH值、初始濃度、料液溫度等對泡沫分離的影響［6－8］，而文冠果果皮皂苷泡沫分離純化的研究尚未見報道。我們應用泡沫分離法對文冠果果皮皂苷進行分離純化，并對其工藝條件優(yōu)化及影響因子作了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

文冠果果皮:采于內(nèi)蒙古赤峰，50℃烘干，粉碎機粉碎。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

儀器:SHB循環(huán)水多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;721紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司;DF204電熱鼓風干燥箱，北京西城區(qū)醫(yī)療器械二廠;高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司;FA10004A電子天平，精天精密儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;6 cm×70 cm樹脂柱;氣體流量計;氣泵。

1.3 實驗方法

1.3.1 文冠果果皮的總皂苷含量測定

稱取干燥恒重的人參皂苷Re 4.35 mg，用無水甲醇定容至10 mL(對照品)。吸取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別加入10 mL試管中，水浴揮盡溶劑，加新配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，70℃水浴加熱15 min，加冰醋酸5.0 mL，搖勻，靜置15 min，立即用分光光度計于546 nm波長處測定吸光度［9］，繪制標準曲線。

稱取干燥恒重的文冠果果皮粉末200 g，置于2 000 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇1 400 mL，70℃冷凝回流5 h。濾去殘渣，回收乙醇至20%，室溫靜置過夜，過濾除去膠質(zhì)，繼續(xù)回收乙醇得浸膏8.365 g。浸膏用8倍水量溶解，3 500 r·min－1離心15 min，上清液用乙酸乙酯 (1∶1，V∶V) 萃取3次，除去雜質(zhì)，水層繼續(xù)用水飽和正丁醇(1∶1，V∶V)萃取3次，合并正丁醇相，濃縮得浸膏［10］。浸膏用60 mL水溶解，經(jīng)濾膜過濾，吸取0.5 mL加入100 mL容量瓶中用甲醇定容至刻度，制備成待測液。吸取0.5 mL待測液于試管中，水浴蒸干溶劑，采用皂苷測定方法，計算出文冠果果皮總皂苷的含量。

1.3.2 泡沫分離法純化文冠果果皮皂苷單因素實驗

分別以初始濃度、氣體流速、溫度、pH為單因素進行單因素實驗，考察各單因素對泡沫分離法純化文冠果果皮皂苷效果的影響，重復3次。

1.3.3 優(yōu)化泡沫分離法純化文冠果果皮皂苷的工藝條件正交試驗

通過單因素水平實驗［11］，篩選確定正交試驗各因素1～3水平 A初始濃度 1，2，3 mg·mL－1，B氣體流速 1.5，2.0，2.5 L·min－1，C溫度 20，35，50℃，D pH值3，5，7。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果果皮的總皂苷含量

以人參皂苷為標準樣，按皂苷的測定方法，y表示吸光度，x表示皂苷的含量，得回歸方程為:y= 2.963 2 x －0.010 3。兩者的相關(guān)系數(shù) R2=0.999 3?？梢?，皂苷含量與溶液吸光度呈密切相關(guān)。據(jù)此測得文冠果果皮的總皂苷含量為1.973%。該檢測方法完全可用于研究泡沫分離工藝檢測皂苷的含量變化。

2.2 初始濃度對皂苷富集效果的影響

在溫度20℃，氣體流速2.5 L·min－1，pH值5的條件下，考察初始濃度對皂苷富集效果的影響，結(jié)果 (圖 1)顯示，在初始濃度為 1～2 mg·mL－1時，隨著初始濃度的增加，富集比升高2.02%，純度升高3.73%;初始濃度在2～5 mg·mL－1時，隨著濃度的增加，回收率升高14.65%，而富集比和純度分別下降29.7%和10.15%。

圖1 初始濃度對皂苷富集比、回收率和純度的影響

究其原因，可能初始濃度1～2 mg·mL－1時，隨著濃度的增加，泡沫穩(wěn)定性增強，夾帶的皂苷量增多，因而提高了富集比;而初始濃度在2～5 mg·mL－1時，隨著濃度增高，形成大量細密穩(wěn)定的泡沫，皂苷量和夾帶的液體量增多，夾帶液的增率高于皂苷的增率，富集比下降。初始濃度在1～2 mg·mL－1時，泡沫夾帶的皂苷量增多，因此純度升高;在2～5 mg·mL－1時，夾帶的皂苷量和非皂苷類固形物也隨之增多，非皂苷類固形物的增率大于皂苷的增率，純度開始降低。隨著濃度的增加，泡沫的穩(wěn)定性增強，夾帶的皂苷量增多，回收率逐漸增大。到達5 mg·mL－1時，回收率雖然升高，但此時富集比和純度下降。由此綜合考慮，初始濃度以2 mg·mL－1左右為宜。

2.3 pH對皂苷富集效果的影響

在初始濃度為2 mg·mL－1，溫度20℃，氣體流速2.5 L·min－1下，考察初始濃度對富集效果的影響，結(jié)果 (圖2)表明，pH值在3～5時，富集比、回收率和純度升高;pH在5～11時，富集比和純度降低。pH在3～7時，隨著pH的升高，回收率升高;pH在7～11時，回收率降低。

圖2 pH值對皂苷富集比、回收率和純度的影響

分析其原因，pH值在3～5時，泡沫穩(wěn)定性增加，泡沫夾帶的皂苷量增多，因而提高了富集比;而當pH值在5～7時，形成大量細密穩(wěn)定的泡沫，皂苷量及夾帶的液體量增多，前者增率小于后者，富集比下降;當pH值在7～11時，泡沫穩(wěn)定性降低，皂苷量及夾帶的液體量均降低，前者降低率大于后者，富集比繼續(xù)下降。pH值在3～5時，泡沫夾帶的皂苷量增多，純度升高;pH值在5～7時，皂苷量及夾帶的非皂苷類固形物增多，前者增率小于后者增率，純度降低;pH在值7～11時，皂苷量及非皂苷類固形物降低，前者降低率大于后者，純度持續(xù)降低。pH值在3～7時，夾帶的皂苷量增多，回收率逐漸增大;pH值在7～11時，泡沫夾帶的皂苷量降低，回收率降低。pH值在5～7時，回收率升高，但富集比和純度下降。綜合考慮，pH值以5左右為宜。

2.4 溫度對皂苷富集效果的影響

如圖3所示，在初始濃度為2 mg·mL－1，氣體流速為2.5 L·min－1，pH值5下，35℃時的富集比比20℃時升高，回收率略有升高，純度降低;從35℃增加到80℃，富集比降低了24.41%，純度降低。20～50℃時，回收率增加;50～80℃時，回收率降低。

圖3 溫度對皂苷富集比、回收率和純度的影響

分析其原因，溫度在20～35℃時，泡沫起泡性增強，泡沫夾帶的皂苷量增多，因而提高了富集比;35～50℃時，泡沫粘度增高，皂苷量及夾帶的液體量增多，前者增率小于后者，富集比下降;溫度在50～80℃，泡沫起泡性減弱，皂苷量及夾帶的液體量減少，前者降低率大于后者，富集比持續(xù)降低;20～50℃時，泡沫中皂苷量及非皂苷類固形物增多，前者增率小于后者，純度降低;溫度在50～80℃時，皂苷量及非皂苷類固形物降低，前者降低率大于后者，純度持續(xù)降低;溫度在20～50℃時，泡沫夾帶的皂苷量增多，回收率增大;溫度在50～80℃時，夾帶的皂苷量減少的，回收率降低;溫度在50℃時，比35℃的回收率升高;pH值在5～7時，回收率升高，但富集比和純度均下降。綜合考慮，溫度以35℃左右為宜。

2.5 氣體流速對皂苷富集效果的影響

在初始濃度為 2 mg·mL－1，溫度20℃，pH值 5的條件下，氣體流速從 1 L·min－1增至 3 L·min－1，富集比降低了 29.02% (圖 4);從 1 L·min－1增到2 L·min－1時，純度達到最高點，氣體流速繼續(xù)增高到 3 mL·min－1時，純度從64.97%降到60.28%。

圖4 氣體流速對皂苷富集比、回收率和純度的影響

分析其原因，當氣體流速為1～3 L·min－1時，隨著氣體流速的升高，氣泡在分離設(shè)備中停留時間短，皂苷量及夾帶的液體量增多，前者增率小于后者，富集比降低;1～2 L·min－1時，皂苷含量增多，純度增大;在氣體流速為 2～3 L·min－1時，皂苷量及夾帶的非皂苷類固形物增多，前者增率小于后者，純度降低;氣體流速為1～3 L·min－1時，皂苷量增多，回收率增大;在氣體流速為3 L·min－1時，回收率升高;pH值5～7時，回收率升高，但富集比和純度均下降。綜合考慮，氣體流速以 2 L·min－1為宜。

2.6 正交試驗結(jié)果

L9(34)正交試驗結(jié)果 (表1)表明，回收率、富集比及純度都是指標越大越好，尤以回收率和純度對于文冠果果皮皂苷的提純更為重要，因此根據(jù)實際的生產(chǎn)需要，回收率及純度的權(quán)重各占40%，富集比占20%。其中，富集比=C0/C;回收率= (C0×V0) /(C×V);純度= (C0×V0) /m0;y= ( y1n/y1max×0.4+ y2n/y2max×0.2+ y3n/y3max×0.4) ×100(C0和 C分別指收集液和初始液中文冠果果皮總皂苷的濃度，V0和V分別指收集液和初始液的體積，m0為收集液烘干后所得產(chǎn)品的質(zhì)量，y為綜合得分，y1為回收率，y2為富集比，y3為純度)。

根據(jù)表1的極差分析可知，文冠果果皮總皂苷泡沫分離效果影響因素的主次為:初始濃度>氣體流速>pH>溫度。

表1 泡沫分離條件的篩選結(jié)果

根據(jù)方差結(jié)果，初始濃度和氣體流速因素均為顯著因素;pH和溫度對分離的影響不顯著。這主要是因為料液的濃度決定了溶液中表面活性物質(zhì)的濃度，從而影響了溶液的起泡能力及泡沫的穩(wěn)定性。氣體流速決定泡沫的產(chǎn)生速度以及泡沫的大小，從而影響文冠果果皮總皂苷的富集和純化。而溫度和pH對溶液的起泡性及泡沫的穩(wěn)定性影響不大。

由表1可以看出，正交實驗得出文冠果果皮總皂苷泡沫分離的最佳工藝條件為A2B3C1D2，即料液初始濃度 2 mg·mL－1，氣體流速 2.5 L·min－1，溫度20℃，pH值5。此時的富集比為3.05，回收率為60.02%，純度為63.35%。

3 小結(jié)與討論

本實驗測得文冠果果皮總皂苷含量為1.973%。不同產(chǎn)地的文冠果果皮皂苷含量變動在1.887 0% ～2.007 8%［12］。本實驗得出文冠果皂苷泡沫分離的最佳工藝條件為:料液初始濃度2 mg·mL－1，氣體流速 2.5 L·min－1，溫度20 ℃ ，pH值5。相對于人參、三七等皂苷泡沫分離時使用的氣體流速來說，文冠果果皮的氣體流速較低，這樣可以更大限度地減少能耗，降低成本。泡沫分離可在室溫條件下進行，避免了加熱所需的能量消耗。經(jīng)測定，文冠果果皮皂苷的水溶液pH值在5左右，所以進行泡沫分離時無需調(diào)節(jié)pH值。此時的富集比為3.05，文冠果皂苷的回收率為60.02%，純度為63.35%。泡沫分離法可以達到較高的富集比，純度和回收率，本實驗使用的是實驗室自制的起泡裝置。人參、三七等皂苷泡沫分離裝置已經(jīng)相應成熟，可以進行工業(yè)化生產(chǎn)，并且可以更好地控制各參數(shù)的變化，如果應用到文冠果果皮皂苷的純化，可進一步提高皂苷的純度和回收率。

可見，泡沫分離法作為初步分離文冠果皂苷的方法是可行的。皂苷應用范圍越來越廣泛，如醫(yī)藥、食品添加、表面活性劑等，對皂苷純度的要求差別較大，故通過氣泡提取得到的皂苷也可能直接應用到食品添加或表面活性劑，而醫(yī)藥要求較高的純度，氣泡提取可作為有效的皂苷初提，對于生物柴油生產(chǎn)，既可節(jié)約提取成本、減少前期投入，又避免了環(huán)境污染，這對促進生物能源樹種文冠果迅速發(fā)展有重要現(xiàn)實意義。

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