黃花榮， 吳敬芳

(中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒科，廣東 廣州 510120)

支氣管哮喘(以下簡稱哮喘)是兒童期最常見的慢性呼吸道疾病，其發(fā)病機制迄今尚未完全闡明。哮喘的本質(zhì)為氣道慢性炎癥，免疫學(xué)發(fā)病機制主要為Thl/Th2反應(yīng)的失衡，Th1類細胞因子分泌不足，Th2類細胞因子產(chǎn)生增加，進而導(dǎo)致IgE合成增加，直接或間接誘導(dǎo)肥大細胞、嗜酸性粒細胞脫顆粒產(chǎn)生氣道高反應(yīng)及炎癥。干擾素－γ(interferon－γ，IFN－γ)、白細胞介素 －4(interleukin－4，IL－4)分別作為Thl、Th2類細胞的特征性細胞因子，在哮喘發(fā)病機制中起重要作用［1，2］。目前認為每類細胞因子基因的調(diào)控區(qū)和啟動子區(qū)的等位基因不盡相同，等位基因的多態(tài)性可能會影響細胞因子的合成，從而造成哮喘發(fā)生的免疫機制更加復(fù)雜。IFN－γ和IL－4基因作為哮喘的遺傳易感基因［3］，能夠較完整地從Th1/Th2的角度研究IFN－γ/IL－4細胞因子基因多態(tài)性與兒童支氣管哮喘的相關(guān)性，國內(nèi)外至今尚未見報道。況且由于人種不同及地區(qū)的差異性，基因多態(tài)性分布也存在著很大的差異。因此，我們對廣東珠三角地區(qū)哮喘兒童IFN－γ和IL－4基因多態(tài)性進行研究分析，以探討其與兒童哮喘易感性及外周血IFN－γ、IL－4和總IgE水平的相關(guān)關(guān)系。

材料和方法

1 材料與儀器

PCR試劑和DNA marker購自寶生物工程有限公司;AvaⅡ和BsmAⅠ內(nèi)切酶購自NEB(北京)有限公司;PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。IFN－γ和IL－4 ELISA kits購自深圳達科為生物科技有限公司，總IgE ELISA kits購自Bio Check。主要儀器:Bio－Rad DNA Engine PCR儀，Labsystems Dragon Wellscan MK 3型酶標測定儀，Applied Biosystems ABI 3730XL基因分析儀。

2 研究對象

選取2009年3月－2010年2月在中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒科哮喘?？崎T診就診的廣東珠三角地區(qū)100例哮喘患兒，年齡2－13(6.57±2.76)歲，其中男51例，女49例。選擇同期在兒科保健門診體檢的健康兒童及小兒外科病區(qū)收治的外傷、骨折等患兒122例為對照組，年齡為3－14(7.46±2.94)歲，其中男70例，女52例。所有對照均無哮喘病史、哮喘家族史、典型過敏性疾病史(包括濕疹、變應(yīng)性鼻炎、特異性皮炎)及近期感染史。2組兒童在性別構(gòu)成、年齡分布上無明顯差異(P＞0.05)。

3 方法

3.1 標本采集及基因組DNA提取 對所有研究對象均采集外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，先留取300 μL全血用于提取基因組DNA，剩余全血離心分離血漿后分裝凍存，用于檢測外周血IL－4、IFN－γ和總IgE含量。取全血300 μL用OMEGA基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，紫外分光光度儀檢測其濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，提取的DNA放置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 IFN－γ基因－179G/T、IL－4基因 －33C/T和－589C/T位點多態(tài)性檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性酶切片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism，PCR －RFLP)技術(shù)檢測，各位點PCR引物序列、退火溫度、PCR產(chǎn)物大小及限制性內(nèi)切酶見表1［4－6］。PCR擴增:PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性4 min，95℃ 40 s，退火40 s(溫度見表1)，72℃ 40 s，共35個循環(huán)，72℃8 min，4℃保存。限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng):酶切反應(yīng)體系 20 μL，置于 37℃(AvaⅡ內(nèi)切酶)或 55℃(BsmAⅠ內(nèi)切酶)水浴消化6 h。酶切產(chǎn)物分析與基因型鑒定:依照酶切產(chǎn)物片段大小選取不同的電泳方法，如瓊脂糖凝膠電泳、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。觀察酶切后電泳凝膠圖像，以DNA marker為內(nèi)參照，確定各研究對象基因型。各位點酶切后不同片段長度對應(yīng)基因型見表2。

表1 PCR引物序列、退火溫度以及限制性內(nèi)切酶Table 1.PCR primer sequences，annealing temperature and restriction enzymes

表2 各位點酶切后不同片段長度對應(yīng)基因型Table 2.Genotype of each locus and length of DNA fragment after restriction enzyme digestion

3.3 IFN－γ基因+874A/T多態(tài)性的檢測 利用等位基因特異性－聚合酶鏈反應(yīng)(allele specificpolymerase chain reaction，AS－PCR)技術(shù)檢測。設(shè)計合成等位基因特異性引物［7］，上游引物T:5'－TTCTTACAACACAAAATCAAATCT －3'，上游引物 A:5'－TTCTTACAACACAAAATCAAACA －3'，通用下游引物:5'－TCAACAAAGCTGATACTCCA －3';β －action上游引物:5'－ CTACAATGAGCTGCGTGTGG －3'，下游引物:5'－AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC －3'。PCR擴增特異性片段，每1例標本分2管擴增，即2次平行的PCR過程。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性4 min，95 ℃ 15 s，62 ℃ 50 s，72 ℃ 40 s，共10 個循環(huán)，95 ℃20 s，56 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，共20 個循環(huán)，72 ℃8 min，4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束以1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物及基因分型。β－action作為內(nèi)參照(500 bp)。如果2管均擴增出包含IFN－γ基因+874位點的目的條帶(264 bp)則為AT基因型;如果含上游引物A的反應(yīng)管擴增出目的條帶，T管無目的條帶則為AA基因型;若含上游引物T的反應(yīng)管擴增出目的條帶，A管無條帶則為TT基因型。

3.4 IFN－γ基因CA重復(fù)序列多態(tài)性的檢測 利用毛細管電泳技術(shù)檢測。先PCR擴增目的片段，上游引物 5'－GCTGTCATAATAATATTCAGAC －3'，下游引物 5'－ CGAGCTTTAAAAGATAGTTCC －3'［8］，其中上游引物5'端加FAM熒光標記。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃40 s，52 ℃40 s，72 ℃40 s，共35個循環(huán)，72℃ 8 min，4℃保存。取適量PCR擴增產(chǎn)物在ABI 3730XL儀器上進行毛細管電泳分離，并加入分子量內(nèi)標進行標記。電泳圖經(jīng)Gene Marker V1.6軟件進行DNA片段長度分析。片段長度122 bp為CA重復(fù)12次，124 bp為CA重復(fù)13次，以此類推。電泳圖為1個波形則為純合子，2個波形為雜合子，以此確定各研究對象的基因型。

3.5 外周血IFN－γ、IL－4和總IgE水平檢測 采用ELISA技術(shù)測定外周血IFN－γ、IL－4和總IgE含量。按照試劑盒操作步驟進行各項指標檢測。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 各位點基因型檢測結(jié)果

本研究中IFN－γ基因－179位點未檢測到突變基因型，所有研究對象均為GG基因型，酶切產(chǎn)物電泳基因分型結(jié)果見圖1。IFN－γ基因+874位點存在AA、AT和TT 3種基因型，PCR產(chǎn)物電泳基因分型結(jié)果見圖2。IFN－γ基因第1內(nèi)含子區(qū)CA重復(fù)序列經(jīng)毛細管電泳技術(shù)檢測顯示，在廣東珠三角地區(qū)人群中CA序列可重復(fù)11次至18次，即存在8個等位基因CA11－CA18，圖3為CA重復(fù)序列毛細管電泳結(jié)果分析圖。IL－4基因－33和－589位點均存在CC、CT和TT 3種基因型，PCR產(chǎn)物電泳基因分型結(jié)果分別見圖4，5。病例組和對照組各位點基因型及等位基因頻率分布情況見表3。經(jīng)Hardy－Weinberg遺傳平衡定律檢驗表明，對照組IFN－γ基因(+874A/T和CA重復(fù)序列)及IL－4基因(－33C/T和－589C/T)各位點基因型頻率均符合Hardy－Weinberg遺傳平衡(均P＞0.05)，說明資料代表性好。

Figure 1.The result of PCR－RFLP at－179 locus of IFN－γ gene.1，9:DNA marker;2，8:PCR product;3 －7:GG genotype.圖1 IFN－γ基因－179位點PCR－RFLP結(jié)果

Figure 2.The result of AS－PCR at+874A/T polymorphism of IFN － γ gene.1:DNA marker;2:TT genotype;3，5:AA genotype;4:AT genotype.圖2 IFN－γ基因+874A/T位點AS－PCR結(jié)果

Figure 3.The result of capillary electrophoresis at CA repeat polymorphism of IFN － γ gene.A:CA12CA12genotype，122 bp;B:CA12CA15genotype，122 bp and 128 bp.圖3 IFN－γ基因CA重復(fù)序列毛細管電泳結(jié)果

表3 病例組和對照組4個多態(tài)性位點的基因型及等位基因頻率分布Table 3.The genotype and allele frequencies of 4 polymorphism loci in IFN－γ and IL－4 gene among asthma patients and control subjects

2 IFN－γ基因+874位點和CA重復(fù)序列多態(tài)性與哮喘的關(guān)聯(lián)分析

哮喘組與對照組IFN－γ基因+874位點AA、AT和TT基因型頻率分別為65.0%與61.5%、33.0%與35.2%、2.0%與3.3%，2組差異無顯著(χ2=0.522，P＞0.05)。等位基因A和T在哮喘組與對照組頻率分別為81.5%與79.1%、18.5%與20.9%，2組差異無顯著(χ2=0.399，P ＞0.05)。

Figure 4.The result of PCR－RFLP at－33C/T polymorphism of IL－4 gene 1，9:DNA marker;8:PCR product;2，5 －7:CT genotype;3:CC genotype;4:TT genotype.The fragment of 15 bp was not displayed because it was running fast on the native polyacrylamide gel.圖4 IL－4基因－33C/T位點PCR－RFLP結(jié)果

Figure 5.The result of PCR－RFLP at－589C/T polymorphism of IL －4 gene.1，10:DNA marker;2:PCR product;3，4，8，9:TT genotype;5，7:CT genotype;6:CC genotype.The fragment of 18bp was dim because it was running fast on the native polyacrylamide gel.圖5 IL－4基因－589C/T位點PCR－RFLP結(jié)果

IFN－γ基因CA重復(fù)序列CA12+CA12+、CA12+CA12－和CA12－CA12－基因型頻率在哮喘組與對照組分別為1.1%與1.7%、28.7%與30.6%、70.2%與67.8%，2組無顯著差異(χ2=0.239，P＞0.05)。等位基因CA12+和CA12－在哮喘組與對照組頻率分別為15.4%與16.9%、84.6%與83.1%，無顯著差異(χ2=0179，P ＞0.05)。

3 IL－4基因－33位點和－589位點多態(tài)性與哮喘的關(guān)聯(lián)分析

IL－4基因－33位點CC、CT和TT基因型頻率在哮喘組與對照組分別為1.0%與2.5%、23.0%與40.2%、76.0% 與 57.4%，2組差異顯著(χ2=8.539，P＜0.05)。等位基因C和T在哮喘組與對照組頻率分別為12.5%與22.5%、87.5%與77.5%，2組差異顯著(χ2=7.502，P ＜0.01)，ORC/T=0.49(95%CI=0.29 －0.82)，ORT/C=2.04(95%CI=1.22－3.41)。

IL－4基因－589位點CC、CT和TT基因型頻率在哮喘組與對照組分別為1.0%與3.3%、19.0%與35.2%、80.0% 與 61.5%，2組差異顯著(χ2=9.161，P＜0.05)。等位基因C和T在哮喘組與對照組頻率分別為10.5%與20.9%、89.5%與79.1%，2組差異顯著(χ2=8.752，P ＜0.01)，ORC/T=0.44(95%CI=0.26 －0.77)，ORT/C=2.25(95%CI=1.30－3.89)。

4 各位點不同基因型外周血IFN－γ、IL－4和總IgE含量的比較

哮喘組IFN－γ濃度(ng/L)(M=17.61，P25=8.68，P75=32.64)明顯低于對照組(M=43.45，P25=32.02，P75=67.41)(P＜0.01)。哮喘組IL－4濃度(ng/L)(M=26.46，P25=12.49，P75=45.35)明顯高于對照組(M=11.42，P25=7.36，P75=17.21)(P＜0.01)。哮喘組總 IgE濃度(103U/L)(M=49.17，P25=16.14，P75=117.20)高于對照組(M=35.42，P25=18.55，P75=62.24)(P＜0.05)。IFN－γ基因+874位點由于TT基因型頻率較少，僅對AA和AT基因型個體IFN－γ含量進行比較，見表4。AA基因型IFN－γ含量低于AT基因型(P＜0.05)。CA重復(fù)序列CA12純合子個體較少，僅比較CA12雜合子(CA12+CA12－)和非CA12純合子(CA12－CA12－)個體IFN－γ含量差異無顯著(P＞0.05)。IL－4基因－33和－589位點均存在3種基因型，但由于CC基因型頻率均較少，故僅對2個位點的CT和TT基因型個體外周血IL－4和總IgE水平進行比較，見表5。－33和－589位點TT基因型外周血IL－4和總IgE濃度均高于CT基因型，經(jīng)檢驗僅有－33位點TT基因型個體外周血IL－4水平高于CT基因型(P＜0.05)。

表4 IFN－γ基因+874A/T位點和CA重復(fù)序列不同基因型IFN－γ水平比較Table 4.The levels of IFN－γ among different genotypes in IFN－γ gene+874A/T and CA repeat polymorphisms

表5 IL－4基因－33C/T和－589C/T位點不同基因型IL－4和總IgE水平比較Table 5.The levels of IL－4 and total IgE among different genotypes in IL－4 gene－33C/T and －589C/T polymorphisms

討 論

哮喘是復(fù)雜的多基因性遺傳病，具有明顯的遺傳易感性。Bream等［9］對美國人群進行研究發(fā)現(xiàn)，IFN－γ基因啟動子區(qū)亦存在多態(tài)性位點即－179G/T，此位點突變后能與轉(zhuǎn)錄激活蛋白－1類似物結(jié)合，在TNF－α誘導(dǎo)下可上調(diào)IFN－γ基因的轉(zhuǎn)錄，從而IFN－γ表達增高。Cabantous等［10］對馬里巴馬科地區(qū)兒童腦型瘧疾研究發(fā)現(xiàn)此位點T等位基因者IFN－γ表達水平增高，從而增強對瘧疾感染的控制，降低腦型瘧疾的發(fā)生。對我國北方漢族人群研究顯示此多態(tài)性位點與HBV感染存在相關(guān)性［4］。但該位點T等位基因的變異率低，我國北方漢族人群為5.71%，在我國南方漢族人群中的分布情況如何?未見有報道。此外，該位點位于啟動區(qū)，通過與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合影響IFN－γ基因轉(zhuǎn)錄，從而影響IFN－γ的表達水平，此位點是否與哮喘存在相關(guān)性，至今國內(nèi)外尚未見報道。本實驗首次對廣東珠三角地區(qū)哮喘兒童和對照兒童進行－179位點研究，結(jié)果顯示該位點未檢測到突變基因型，所有研究對象均為GG純合子，說明IFN－γ基因－179位點可能與哮喘易感性無關(guān)聯(lián)。

Hussein等［7］對埃及地區(qū)75名特應(yīng)性疾病患者(特異性哮喘、特異性皮炎、變應(yīng)性鼻炎)研究顯示，+874 A/T多態(tài)性與特應(yīng)性疾病顯著相關(guān)，并且IgE水平和嗜酸粒細胞數(shù)升高及血清IFN－γ降低程度在基因型AA組同TT組相比有顯著差異。國內(nèi)也有學(xué)者研究顯示此多態(tài)性位點可能與我國重慶地區(qū)成人哮喘的遺傳易感性相關(guān)［11］。本研究結(jié)果顯示:IFN－γ基因+874位點AA、AT和TT基因型頻率分布在哮喘組與對照組之間無顯著差異，P＞0.05。但通過對不同基因型血漿IFN－γ水平比較發(fā)現(xiàn)，AA基因型組IFN－γ水平明顯低于基因型AT組(P＜0.05)，874位點多態(tài)性與血漿IFN－γ水平存在著相關(guān)性，是否影響哮喘疾病的嚴重程度，影響疾病的預(yù)后，尚需進一步研究。

CA重復(fù)序列位于IFN－γ基因第1內(nèi)含子區(qū)。毛細管電泳技術(shù)檢測顯示，在廣東珠三角地區(qū)人群CA序列可重復(fù)11次至18次，即存在8個等位基因CA11－CA18，這與臺灣學(xué)者的研究結(jié)果不同，在臺灣人群中CA序列可重復(fù)12次至18次［12］。此外，印度學(xué)者研究顯示印度人CA序列可重復(fù)10次至18次［13］。本文對哮喘組和對照組 CA重復(fù)序列的CA12+CA12+、CA12+CA12－和CA12－CA12－3種基因型頻率分布進行比較，并未發(fā)現(xiàn)其與哮喘易感性相關(guān)，這與Kumar等［14］的研究結(jié)果一致。但臺灣學(xué)者［12］和印度學(xué)者［13］研究顯示此位點與哮喘存在相關(guān)性。這可能與人種的不同、地區(qū)差異以及研究方法不一致有關(guān)。我們同時對不同基因型個體血漿IFN－γ水平進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CA12+CA12－基因型IFN－γ含量與CA12－CA12－基因型無顯著差異(P＞0.05)。

IL－4基因－33C/T位點位于起始密碼子ATG上游－33 bp處，同時也是轉(zhuǎn)錄起始點下游33 bp位置，又記做 +33C/T。Gervaziev等［15］對俄羅斯人群研究顯示，此位點與哮喘易感性及哮喘患者體內(nèi)IL－4、血漿總IgE水平存在相關(guān)性。我國學(xué)者研究顯示此位點與哮喘易感性和血清總IgE水平升高相關(guān)聯(lián)［16］。這可能由于此位點的變異改變了其與CREB(c－AMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白)結(jié)合的穩(wěn)定性，進而影響了IL－4基因轉(zhuǎn)錄［15］，也可能是由于 －589位點與－33位點存在連鎖不平衡。但是，有學(xué)者對臺灣地區(qū)哮喘患者13個多態(tài)性位點進行研究，結(jié)果顯示－33C/T位點與哮喘無相關(guān)性［17］。本組資料研究顯示－33位點基因型和等位基因頻率分布在哮喘組和對照組均有顯著差異，T等位基因是哮喘易感基因，T等位基因者患哮喘的風險是C等位基因者的2.04倍。同時也發(fā)現(xiàn)－33位點TT基因型個體外周血IL－4濃度均高于CT基因型者，但對－33位點不同基因型的總IgE水平進行比較卻未發(fā)現(xiàn)兩者的相關(guān)性。本研究結(jié)果提示－33位點多態(tài)性與哮喘易感性存在密切關(guān)系，T等位基因增加患哮喘的風險，可能通過影響IL－4表達參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展。

伊朗學(xué)者研究顯示IL－4基因－589位點T等位基因與哮喘易感性相關(guān)［6］。俄羅斯學(xué)者研究顯示此位點與哮喘患者體內(nèi)IL－4水平、血清總IgE水平亦存在相關(guān)性［15］。此外，對臺灣人群的研究顯示該多態(tài)性位點與哮喘易感性及氣道高反應(yīng)性(的嚴重度)密切相關(guān)，但與血清總IgE水平無相關(guān)性［18］。我們的研究顯示:－589位點基因型和等位基因頻率分布在哮喘組和對照組均有顯著差異。T等位基因是哮喘易感基因，T等位基因者患哮喘的風險是C等位基因者的2.25倍。進一步對－589位點多態(tài)性與血漿IL－4和總IgE水平的相關(guān)性進行分析，結(jié)果顯示－589位點與血漿IL－4和總IgE并無相關(guān)性。哮喘是一個復(fù)雜的疾病過程，眾多免疫細胞及其產(chǎn)生的細胞因子參與其發(fā)病，血漿IL－4和總IgE濃度可能還受到其它因素的影響。

對哮喘相關(guān)基因多態(tài)性的研究還處于初始階段，隨著分子遺傳學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對哮喘相關(guān)基因多態(tài)性進行深入的研究，將對哮喘發(fā)病機制探討、確定哮喘易感個體和哮喘的基因治療提供理論基礎(chǔ)。

［1］黃花榮，劉甜甜，魏 菁，等.哮喘患兒外周血淋巴細胞CD40/CD40L表達及其與Tc1和Tc2的關(guān)系［J］.中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2007，28(1):79 －82.

［2］黃花榮，劉甜甜，魏 菁，等.糖皮質(zhì)激素吸入對哮喘患兒外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞水平的影響［J］.中國病理生理雜志，2009，25(11):2204 －2207.

［3］吳敬芳，黃花榮.干擾素－γ和白細胞介素－4基因多態(tài)性與支氣管哮喘［J］.國際內(nèi)科學(xué)雜志，2009，36(11):676－678.

［4］Qi S，Cao B，Jiang M，et al.Association of the －183 polymorphism in the IFN－gamma gene promoter with hepatitis B virus infection in the Chinese population［J］.J Clin Lab Anal，2005，19(6):276 －281.

［5］Takabayashi A，Ihara K，Sasaki Y，et al.Novel polymorphism in the 5'－untranslated region of the interleukin－4 gene［J］.J Hum Genet，1999，44(5):352 － 353.

［6］Kamali－Sarvestani E，Ghayomi MA，Nekoee A，et al.Association of TNF－alpha －308 G/A and IL－4 －589 C/T gene promoter polymorphisms with asthma susceptibility in the south of Iran［J］.J Investig Allergol Clin Immunol，2007，17(6):361 －366.

［7］Hussein YM，Ahmad AS，Ibrahem MM，et al.Interferon gamma gene polymorphism as a biochemical marker in Egyptian atopic patients［J］.J Investig Allergol Clin Immunol，2009，19(4):292 －298.

［8］Nakao F，Ihara K，Kusuhara K，et al.Association of IFN－gamma and IFN regulatory factor 1 polymorphisms with childhood atopic asthma［J］.J Allergy Clin Immunol，2001，107(3):499 －504.

［9］Bream JH，Ping A，Zhang X，et al.A single nucleotide polymorphism in the proximal IFN－gamma promoter alters control of gene transcription［J］.Genes Immun，2002，3(3):165－169.

［10］Cabantous S，Poudiougou B，Traore A，et al.Evidence that interferon－gamma plays a protective role during cerebral malaria［J］.J Infect Dis，2005，192(5):854 －860.

［11］Li Y，Wu Bo，Xiong H，et al.Polymorphisms of STAT－6，STAT－4 and IFN－gamma genes and the risk of asthma in Chinese population［J］.Respir Med，2007，101(9):1977－1981.

［12］Wang TN，Chu YT，Chen WY，et al.Association of interferon－gamma and interferon regulatory factor 1 polymorphisms with asthma in a family－based association study in Taiwan［J］.Clin Exp Allergy，2006，36(9):1147－1152.

［13］Nagarkatti R，B－Rao C，Rishi JP，et al.Association of IFNG gene polymorphism with asthma in the Indian population［J］.J Allergy Clin Immunol，2002，110(3):410 －412.

［14］Kumar A，Ghosh B.A single nucleotide polymorphism(A→G)in intron 3 of IFN gamma gene is associated with asthma［J］.Genes Immun，2008，9(4):294 －301.

［15］Gervaziev YV，Kaznacheev VA，Gervazieva VB，et al.Allelic polymorphisms in the interleukin－4 promoter regions and their association with bronchial asthma among the Russian population［J］.Int Arch Allergy Immunol，2006，141(3):257 －264.

［16］王修海，趙 煒，劉世國，等.白細胞介素4和13基因多態(tài)性對支氣管哮喘患者易感性及血清總IgE水平的影響［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2009，32(3):161－164.

［17］Wang JY，Liou YH，Wu YJ，et al.An association study of 13 SNPs from seven candidate genes with pediatric asthma and a preliminary study for genetic testing by multiple variants in Taiwanese population［J］.J Clin Immunol，2009，29(2):205 －209.

［18］Chiang CH，Tang YC，Lin MW，et al.Association between the IL－4 promoter polymorphisms and asthma or severity of hyperresponsiveness in Taiwanese［J］.Respirology，2007，12(1):42 －48.