楊嘉琳， 董偉華， 孔天翰△

(1廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510150;2廣州醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，廣東 廣州 510182)

舟山眼鏡蛇(Naja atra Cantor)咬傷是我國南方最常見的蛇傷之一，尤其在廣東、廣西地區(qū)位于毒蛇咬傷的首位。目前，蛇傷后的分期、分型尚缺乏實驗室檢查的有關(guān)特異性指標(biāo)，故臨床上大多據(jù)患者的系統(tǒng)癥狀(神經(jīng)、呼吸、消化、泌尿及血液系統(tǒng)等)及局部體征(出血、水腫、疼痛等)將蛇傷分為輕型、重型(功能障礙期)及危重型(功能衰竭期)［1］?？股叨狙迨侵委熒邆氖走x特效藥，蛇傷后2 h內(nèi)應(yīng)用抗蛇毒血清能明顯縮短病程和減輕臟器損害，可獲得最佳的臨床療效［2］;亦有報道于毒蛇咬傷6－8 h內(nèi)應(yīng)用抗蛇毒血清，96%以上病例可在1－2 d即可治愈出院［3］。由于蛇毒進(jìn)入機(jī)體后有特定的代謝過程，當(dāng)血液中游離蛇毒素含量低于特定值以后，再輸入抗血清非但不足以提高療效，相反還增加嚴(yán)重過敏反應(yīng)的風(fēng)險。另外，作為生物藥品的抗血清在使用過程中還存在著諸多不足，如難保管、易變質(zhì)及價格昂貴等，因此系統(tǒng)研究抗血清使用的時效性，以確定最佳使用時段及無效時段的下限，對指導(dǎo)正確、合理使用抗蛇毒血清，提高臨床療效有重要意義。本實驗用不同挑戰(zhàn)劑量(2 LD50［4］、4 LD50［5］)舟山眼鏡蛇毒以建立大鼠蛇傷模型，通過系統(tǒng)觀察蛇傷后大鼠相關(guān)器官功能動態(tài)變化，依據(jù)多項實驗室指標(biāo)結(jié)果，提出了重度蛇傷后分期的假設(shè)，同時探討了抗血清對動物保護(hù)時效性與相關(guān)實驗室指標(biāo)變化的關(guān)系，為優(yōu)化眼鏡蛇傷的臨床治療方案、動態(tài)監(jiān)測抗血清應(yīng)用的實際療效提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 主要儀器設(shè)備

蛇毒取毒器 (專利號為 ZL200420046279.9，由廣州蛇毒研究所自行研制);Sychron LX20全自動生化分析儀(Beckman Coulter);Sysmen CA－600全自動凝血分析儀(日本希森美康公司);LD4－低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);i－STAT多功能血液分析儀(雅培公司);真空采血管。

2 主要試劑

2.1 蛇毒的制備 成年舟山眼鏡蛇購自廣州白云區(qū)茶山福蛇場，用自制的蛇毒取毒器取毒，黏稠而淡黃色毒液按1∶4比例加入自制的蛇毒保護(hù)液(可避免細(xì)菌、蛋白酶及環(huán)境高溫對蛇毒抗原性的破壞)稀釋，3000×g離心30 min去沉淀，－20℃冷凍，真空、低溫干燥為凍干粉，4℃密閉保存。生理鹽水配成0.57 g/L溶液，分裝后放于－20℃冷凍備用。

2.2 抗蛇毒血清 精制抗眼鏡蛇毒血清(1000 IU/瓶，上海賽倫生物技術(shù)有限公司，批號為20070701)。

2.3 其它試劑 肝素、2%戊巴比妥鈉、生理鹽水;cTnl EG3+測試片。

3 蛇傷模型制備

動物由廣東省實驗動物中心提供，SPF級SD大鼠，體重(230±20)g，雄性，合格證號為粵監(jiān)證字2007A003。按給藥的不同分為對照組、4 LD50蛇毒和2 LD50蛇毒3組，2個蛇毒劑量分別按2.544 mg/kg(4 LD50)、1.272 mg/kg(2 LD50)于背部脊柱一側(cè)胸廓下緣皮下注毒0.1 mL，剩余的蛇毒全部以肌下5－10 mm平均注入左、右腓腸肌內(nèi)。

4 蛇傷多項指標(biāo)動態(tài)觀察

4.1 生化檢測 取4 LD50蛇傷模型大鼠分為0、20、40、60、80、100、120 min 7 組，另取 2 LD50蛇傷模型大鼠分為 0、20、40、60、80、100、120、140 min 8 組，每組10只。注毒后立即開胸取血者為0 min組，其余組取血與注毒后相應(yīng)時間對應(yīng)。每只大鼠直視下心臟取血3 mL裝無抗凝試管中并分離出血清，用Sychron LX20全自動生化分析儀檢測以下項目:谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)、磷酸肌酸激酶(creatine kinase，CK)、磷酸肌酸激酶同工酶(creatine kinase，CK － MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、肌酐(creatinine，Cr)、總膽紅素 (serum total bilirubin，STB)、間接膽紅素(unconjugated bilirubin，UCB)、直接膽紅素(conjugated bilirubin，CB)。

4.2 病理檢查 上述動物心臟取血后處死，取4 LD50組的右側(cè)大腿肌肉(注毒位置)及心肌行病理檢查。

4.3 檢測血氣分析 取4 LD50蛇傷模型大鼠分為0、20、40、60、80、100、120 min 7 組，每組 10 只。大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉(2.3 mL/kg)腹腔麻醉，呈仰臥位固定于大鼠手術(shù)臺上，切開頸前部皮膚，分離左側(cè)頸總動脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，近心端經(jīng)硬膜外導(dǎo)管(3F)連接三通頭，以少量肝素封管后備用。按不同時間段以2 mL注射器自置管處抽取頸動脈血液0.1－0.2 mL，以cTnl EG3+測試片用i－STAT多功能血液分析儀行血氣分析檢測，記錄結(jié)果pH值、二氧化碳分壓(pressure of carbondioxide，PCO2)、氧分壓(pressure of oxygen，PO2)、碳酸氫根(bicarbonate，HCO3－)、血漿二氧化碳含量(content total plasma，TCO2)、剩余堿(bases excess，BE)、氧飽和度 (oxygen saturation，SO2)。

5 抗血清保護(hù)

取4 LD50蛇傷模型大鼠分為血清(40、60、80、100、120 min)及蛇毒對照共6組。40 min組為注毒后40 min經(jīng)腹腔注射精制抗眼鏡蛇毒血清(血清/蛇毒:125 kU/g)，60、80、100 及 120 min 組分別于 60、80、100、120 min注入同量抗血清。統(tǒng)計存活時間、保護(hù)率，存活時間超過180 min按存活數(shù)(只)計。平均存活時間為死亡時間與存活時間(按＞180 min計)之和的均數(shù);保護(hù)率=(蛇毒組死亡率－血清保護(hù)組死亡率)/蛇毒組死亡率。

6 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 蛇傷模型制備

注入2倍LD50蛇毒(1.272 mg/kg)，大鼠平均存活時間(300.0 ±19.2)min;按 0、20、40、60、80、100、120、140 min共8個時點取樣進(jìn)行相關(guān)的檢測。

注入4倍 LD50蛇毒(2.544 mg/kg)后，大鼠于121－140 min之間的死亡率達(dá)到50%;至160 min時，死亡率已達(dá) 80%，見表 4。按 0、20、40、60、80、100、120 min共7個時點取樣進(jìn)行相關(guān)的檢測。

2 生化功能檢測

2.1 心、肝酶檢測結(jié)果

①4 LD50AST、CK、CK－MB于注毒后明顯上升，于60 min、120 min時點各出現(xiàn)1峰值，且120 min時點為最高值，80 min時點則為1谷值，40－120 min時點的5個時間段與0 min相比均有顯著差異(P＜0.05);其中 CK、CK－MB上升更為明顯，其值在120 min時點較0 min時上升6－7倍，對比極顯著差異(P＜0.01)。LDH于注毒后20 min已開始上升，于60 min時點出現(xiàn)峰值，之后逐漸下降，120 min時點僅出現(xiàn)輕度上升，見表1、圖1。②2 LD50與4 LD50相比心酶未出現(xiàn)2個明顯峰值，CK－MB在100 min時點出現(xiàn)峰值，CK在80 min時點出現(xiàn)峰值，之后有所下降，140 min時點再次出現(xiàn)上升，但不及100 min前的峰值高;AST于60－100 min時點出現(xiàn)1平臺期，140 min時點達(dá)到最高值;LDH于100 min時點出現(xiàn)峰值，之后逐漸下降，未再上升，120、140 min 2個時點與0 min相比有顯著差異(P＜0.05)。各心酶的最高值均較4 LD50劑量組記錄的最高值低，見表2、圖2。

表1 注入4 LD50眼鏡蛇毒后不同時點大鼠生化、血氣分析指標(biāo)檢測Table 1.The biochemical indicators and blood gas analysis test at different time points after injection of 4 LD50of cobra venom in rats(n=10)

Figure 1.CK，CK －MB and pH curves in 4 LD50group.圖1 4LD50組CK、CK－MB和pH 曲線圖

表2 注入2 LD50眼鏡蛇毒后不同時點大鼠生化指標(biāo)檢測Table 2.The biochemical indicators test at different time points after injection of 2 LD50of cobra venom in rats(n=10)

Figure 2.CK and CK－MB curves in 2 LD50and 4 LD50groups圖2 2 LD50和4 LD50組的CK、CK－MB曲線

2.2 肝酶 ALT于注毒后進(jìn)行性升高，在同種劑量組中其上升幅度不如心酶大。

①4 LD5060 min時點達(dá)到第1個峰值，80 min時點有一下降點，之后又再上升，120 min時點達(dá)到第2個峰值、亦是最大值;60、120 min兩個時點與0 min時點相比有顯著差異(P＜0.05)，見表1。

②2 LD50在60－100 min時則出現(xiàn)平臺期，于140 min時點升到最高值，但其最高值較4 LD50120 min時點的最高值小，見表2。

2.3 膽紅素 4 LD50與2 LD50中均可見STB上升，且有2個峰值:分別于60、100 min 2個時點(4 LD50)以及80、100 min 2個時點(2 LD50)出現(xiàn)。膽紅素中的CB、UCB并不是同時升高;CB較UCB升高早，在60 min時點(4 LD50)，80 min時點(2 LD50)出現(xiàn)峰值;UCB則在后期升高，在100 min時點(4 LD50、2 LD50)出現(xiàn)峰值。各組的峰值與0 min時點相比均有顯著差異(P ＜0.05)，見表1、2。

2.4 腎功能

①4 LD50血Cr于40、120 min 2個時點各出現(xiàn)1峰值，120 min時點為最高值，60 min期為1谷值。20、100、120 min時點分別與0 min時點對比均有顯著差異(P ＜0.05)，見表1。②2 LD50Cr在60 min時點后有輕度上升，但0 min時點與各時點相比均無顯著差異，變化不明顯，見表2。

3 血氣分析

4 LD50:HCO3－、BE、TCO2于注毒后出現(xiàn)下降，且為進(jìn)行性下降，其中 BE、TCO2中 60、80、100、120 min時點與0 min相比有極顯著差異(P＜0.01);pH值則于80 min時點后才出現(xiàn)下降，在此之前能維持相對穩(wěn)定，20、40、60 min時點分別與0 min組對比均無顯著差異(P＞0.05);PCO2于40 min時點開始下降，至60 min時點降至最低值，80 min時點后出現(xiàn)升高，至120 min時點升至最高點;PO2于40 min時點開始上升，40 min時點為最高值，80 min時點后出現(xiàn)下降，至120 min時點降至最低點，見表1、圖1。

4 病理檢查

4.1 4 LD50大腿肌肉 0 min時點:肌肉纖維結(jié)構(gòu)基本正常，少部分肌束胞漿嗜伊紅染色，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰，橫紋可見;20 min時點:部分肌肉纖維節(jié)段性變性，肌肉橫紋消失，大部分心肌纖維結(jié)構(gòu)無異常肌;40 min時點:細(xì)胞濁腫較前(20 min時點)明顯，細(xì)胞正常與濁腫比例介于1/2－2/3之間，少量淋巴細(xì)胞浸潤;60 min時點:大部分肌纖維橫紋消失，并見部分壞死及淋巴細(xì)胞浸潤;100 min時點:大部分肌纖維壞死，呈空泡狀，并見淋巴細(xì)胞灶性浸潤;120 min時點:基本上所有肌束均明顯濁腫、變性，見圖3A－C。

4.2 4 LD50心肌 0 min時點:心肌橫紋清晰;20 min時點:少部分心肌纖維濁腫，大部分心肌橫紋清楚;40 min時點:心肌橫紋消失，胞漿濁腫;60 min時點:心肌纖維廣泛濁腫變性，可見凝固性壞死，心肌間見紅細(xì)胞;80 min時點:心肌細(xì)胞廣泛變性，可見收縮帶;100 min時點:心肌纖維廣泛變性、濁腫，可見凝固性壞死;120 min時點:心肌細(xì)胞明顯變性、濁腫，并見炎癥細(xì)胞浸潤，見圖3D－F。

5 抗蛇毒血清保護(hù)組

4 LD50注毒后40 min時點施予血清，所有大鼠的中毒癥狀均不明顯，各項生命體征均基本穩(wěn)定，平均存活時間約120 min，存活率為100%，保護(hù)率則為80%，與蛇毒組相比有非常顯著差異(P＜0.01);60 min、80 min、100 min 時點血清組存活率、保護(hù)率及平均存活時間呈線性下降，與蛇毒組相比差異明顯(P＜0.05);而120 min時點血清組的存活率為40%，保護(hù)率僅為20%，平均存活時間與蛇毒組非常接近，無顯著差異，見表3。

表3 注入4 LD50眼鏡蛇毒后不同時點施予抗血清對大鼠存活時間的影響Table 3.After injection of 4 LD50cobra venom in rats，the effecf of giving antivenin on the survival time of rats at different time points(n=10)

討 論

眼鏡蛇屬混合類蛇毒，神經(jīng)毒、血循毒兼有之。其主要毒性成分為神經(jīng)毒素、細(xì)胞毒素、磷脂酶A2(PLA2)等。細(xì)胞毒素(cytotoxin，CTX)又稱為心臟毒素，對心臟和呼吸有明顯毒性;CTX可直接損傷細(xì)胞生物膜導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、壞死，細(xì)胞通透性改變使CK －MB、AST 等釋放增多［6］。

從表4可知，在60 min時點時，肝酶、心酶均出現(xiàn)第1個峰值，提示肝臟、心臟功能受損明顯。近年來國外的藥代動力學(xué)研究表明，眼睛蛇毒的各種成分在深部組織中的快速分布時間為22－47 min［7］。而國內(nèi)對舟山眼鏡蛇蛇毒及其相關(guān)組份藥代動力學(xué)研究表明，其在哺乳動物體內(nèi)的快分布相半衰期(T1/2)為40 min左右，3個不同劑量(75、150和300 μg/kg)的眼鏡蛇毒組份60 min僅能改變曲線下面積，但對T1/2無顯著影響［8］。在本實驗中，酶學(xué)的第1個峰值出現(xiàn)在注毒后60 min，說明蛇毒在大鼠體內(nèi)經(jīng)快速分布擴(kuò)散或滲透入機(jī)體重要靶器官，從而對心、肝等組織造成了直接的損傷。

表4 注入4 LD50蛇毒肖后不同時點相關(guān)指標(biāo)的差異Table 4.4 LD50snakebite related indicators at different time points

在80 min時點，酶學(xué)曲線表現(xiàn)為“谷值”，大鼠多項生化指標(biāo)較60 min時點有所下降，該種現(xiàn)象可能與毒素已基本完成在體內(nèi)的快分布并已有部分被清除，此時毒素對各臟器細(xì)胞直接損傷亦較前一時點相對減少，加之機(jī)體尚有一定的自我修復(fù)能力，故在酶學(xué)上檢測到的相關(guān)指標(biāo)有所下降，呈現(xiàn)出“好轉(zhuǎn)”的假象。

眼鏡蛇傷大鼠在生化檢測方面表現(xiàn)為2個峰值，而血氣分析的檢測則可用于區(qū)分這2個峰值;若生化檢測提示心、肝功能損傷而pH正常，則提示為第1個峰值，而且處于蛇傷早期(相當(dāng)于本次實驗中的0－60 min時點);反之，若存在多器官功能損傷且合并血氣分析檢查提示代謝性酸中毒，則為第2個峰值，則為蛇傷后期(相當(dāng)于本次實驗中的80－120 min時點)。結(jié)合抗蛇毒血清組的結(jié)果可知，在蛇傷的早期(0－60 min時點)，及時使用抗蛇毒血清能取得很好的療效;而在蛇傷的后期(80－120 min時點)，因蛇毒已使部分靶器官的細(xì)胞產(chǎn)生不可逆損傷，抗蛇毒血清的保護(hù)作用大大降低，故此時在使用抗蛇毒血清之外，治療重點應(yīng)放在防止并發(fā)癥以及生命支持等治療上，如:糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用，機(jī)械通氣治療，血液凈化等［11］。另外，我們提出動態(tài)觀察多項指標(biāo)的變化，可更科學(xué)地指導(dǎo)抗蛇毒血清的應(yīng)用以及提高對癥治療的療效。

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