黃秀榕， 祁明信， 張可麗， 郭 娜

(福建中醫(yī)藥大學(xué)1病理生理研究中心，2附屬第二人民醫(yī)院眼科，福建 福州 350003)

近年來的流行病學(xué)調(diào)查研究和實驗研究結(jié)果［1，2］從不同角度表明老年性白內(nèi)障與雌激素間存在一定的相關(guān)性。在核性、后囊下和皮質(zhì)性白內(nèi)障3種類型之中，女性白內(nèi)障的患病率都高于男性，而當(dāng)服用雌激素后，女性核性白內(nèi)障患病率有所下降;單獨應(yīng)用雌激素或雌激素－孕激素聯(lián)合應(yīng)用的激素替代療法與降低白內(nèi)障的風(fēng)險有聯(lián)系，絕經(jīng)后使用雌激素可減少白內(nèi)障的發(fā)生，對晶狀體透光性有保護(hù)作用;典型閉經(jīng)的激素水平與白內(nèi)障的發(fā)生也有顯著的依從性;在對SD大鼠應(yīng)用甲基亞硝脲誘導(dǎo)的年齡相關(guān)性白內(nèi)障模型中研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢后未予雌激素組晶狀體混濁眼數(shù)較給予雌二醇或雌酮組高，未用雌激素組晶狀體透光率較使用雌激素組低;抗雌激素藥他莫昔芬使用5年以上可增加發(fā)生白內(nèi)障的危險，這可能與阻斷晶體氯離子通道而導(dǎo)致晶狀體混濁有關(guān)。而近年的實驗研究表明，很多富含植物雌激素的中藥，如補(bǔ)骨脂、牛膝、葛根、淫羊藿、黑升麻、虎杖等具有類雌激素活性［3］，異補(bǔ)骨脂素(isopsoralen，ISR)為中藥補(bǔ)骨脂的有效單體，歸腎、脾經(jīng)，溫腎助陽，腎屬水，肝屬木，水可生木，即腎可生肝，而肝開竅于目。本實驗選取ISR作用于H2O2處理的人晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells，HLECs)，探討其對老年性白內(nèi)障的防治作用。

材料和方法

1 材料

1.1 儀器 流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer，F(xiàn)CM)(BD FACScan)、CO2培養(yǎng)箱(FORMA 2111)、倒置相差顯微鏡(Olympus IMT－413)、超凈工作臺(江蘇SW－CJ－IF)、微量移液器(Gilson)、冰箱(青島BCD－268)、超低溫冰箱(MDF－V5410)、電熱式壓力消毒器(上海 YXQ.SG41)、數(shù)字酸度計(上海 PHS－25)、微量電子天平(上海FA200X)、低速水平離心機(jī)(北京LD4－2)、恒溫水浴鍋(深圳HH－4)、干燥箱(上海101A－2)、自動三重純水蒸餾器(上海SZ－97)、真空泵(EF006)。

1.2 試劑 雌二醇(β －estradiol，E2)粉末，純度97%，Sigma;ISR粉末，購自中國藥品生物制品檢定所;胰蛋白酶(trypsin)為美國Gibco產(chǎn)品，乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)為 Augus產(chǎn)品，購自華美生物工程公司;DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium)干粉為Gibco產(chǎn)品，牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)為Amresco產(chǎn)品，新生牛血清(newborn calf serum，NCS)為奧地利PAA產(chǎn)品，購自廈門泰京生物技術(shù)有限公司;HEPES為 Amresco產(chǎn)品，Triton X－100、NP－40為Sigma產(chǎn)品，購自廈門鷺隆生物技術(shù)有限公司;兔抗人ERα、β多克隆抗體為Santa Cruz產(chǎn)品，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔抗體，購自北京中山生物技術(shù)有限公司;青霉素系福建匯天生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，鏈霉素為大連美羅大藥廠產(chǎn)品;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 HLECs培養(yǎng) 取出保存凍存細(xì)胞的凍存管立即放入37℃水中，將溶解的細(xì)胞懸液用10倍體積以上的培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，離心，除上清，反復(fù)洗滌3次。以5×108cells/L接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長融合后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2 E2溶液配制 取 E2粉末0.0136 g，溶于0.5 mL無水乙醇，待完全溶解后，加無水乙醇至5 mL，配制成10－2mol/L的儲存液，分裝，－20℃凍存?zhèn)溆茫R用前用滅菌后的三蒸水稀釋成10－4mol/L的工作液。

2.3 ISR溶液配制 取ISR粉末0.0091 g，溶于0.5 mL無水乙醇，待完全溶解后，加無水乙醇至5 mL，配制成10－2mol/L的儲存液，分裝，－20℃凍存?zhèn)溆?，臨用前用滅菌后的三蒸水稀釋成10－4mol/L的工作液。

2.4 核分離液配制 分別稱取BSA 0.5 g，HEPES 0.59575 g，依次將其溶解于80 mL PBS(溶解時必須待一種試劑完全溶解后，再加入下一種試劑，直至所有試劑溶解后混勻)，加入0.6 mL NP－40，補(bǔ)加PBS至100 mL混勻，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 反應(yīng)緩沖液配制 稱取BSA 2.5 g，將其溶解于180 mL PBS，加入 0.125 mL Triton X －100，補(bǔ)加PBS至200 mL混勻，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 分組與給藥 對照組:HLECs+含10%NCS的DMEM培養(yǎng)液;H2O2組:對照組 +3×10－4mol/L H2O2;E2組:H2O2組 +10－8mol/L E2;ISR 組(高濃度):H2O2組 +10－5mol/L ISR;ISR組(中濃度):H2O2組+10－6mol/L ISR;ISR組(低濃度):H2O2組+10－7mol/L ISR。

各ISR組提前加藥孵育1 h后，再加入H2O2，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行檢測。

2.7 FCM檢測經(jīng)H2O2處理的HLECs上雌激素受體 α(estrogen receptor α，ERα)和 β(ERβ)的表達(dá)取對數(shù)期生長的細(xì)胞，常規(guī)消化，收集，細(xì)胞密度為(1－2)×109cells/L，PBS洗滌1次，每組設(shè)7個平行樣本(其中一個為陰性對照);用－20℃預(yù)冷的100% 甲醇－20℃固定20 min;PBS洗滌2次，用4℃預(yù)冷的核分離液室溫處理10 min，用反應(yīng)緩沖液洗滌2遍;加入含有1%BSA及1%NCS的 PBS 50 μL，混勻后室溫中放置30 min;反應(yīng)緩沖液洗滌2遍，分別加入1∶100稀釋(稀釋液為0.01 mol/L的磷酸鈉緩沖液，pH7.6)的Ⅰ抗(ERα抗體、ERβ抗體)，4℃反應(yīng)過夜(陰性對照組以PBS代替Ⅰ抗，其它步驟同前，以便試機(jī)、調(diào)零)，然后用反應(yīng)緩沖液洗滌2遍;加入1∶50稀釋(稀釋液為0.01 mol/L的磷酸鈉緩沖液，pH 7.6)的FITC標(biāo)記的Ⅱ抗，置冰上避光放置30 min;反應(yīng)緩沖液洗滌2遍，加入1 mL PBS懸浮細(xì)胞，上機(jī)做流式細(xì)胞分析，檢測ERα、ERβ蛋白陽性率。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 FCM檢測ISR對經(jīng)H2O2處理的HLECs ERα表達(dá)的影響

FCM檢測結(jié)果顯示(表1、圖1):正常HLECs存在ERα的表達(dá);H2O2組HLECs內(nèi)ERα表達(dá)明顯下降，與對照組比較有顯著差異(P＜0.01);E2、ISR高、中、低濃度組的HLECs內(nèi)ERα表達(dá)明顯升高，與H2O2組比較有顯著差異(P＜0.01);且隨ISR濃度的增高HLECs內(nèi)ERα表達(dá)逐漸升高，呈明顯的濃度依賴關(guān)系。

表1 FCM檢測不同濃度ISR對經(jīng)H2O2處理的HLECs ERα表達(dá)的影響Table 1.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERα in HLECs incubated with H2O2(.n=6)

表1 FCM檢測不同濃度ISR對經(jīng)H2O2處理的HLECs ERα表達(dá)的影響Table 1.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERα in HLECs incubated with H2O2(.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group;▲▲P ＜ 0.01 vs H2O2group.

Group ERα(%)Control 33.552 ±2.147 H2O2 21.428 ±1.491＊＊E2 31.470 ±1.536▲▲ISR(10 －5mol/L) 36.350 ±2.498▲▲ISR(10 －6mol/L) 31.402 ±1.940▲▲ISR(10 －7mol/L) 25.390 ±0.722▲▲

Figure 1.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERα in H2O2－treated HLECs examined by flow cytometry.圖1 FCM檢測不同濃度ISR對經(jīng)H2O2處理的HLECs ERα表達(dá)的影響

2 FCM檢測ISR對經(jīng)H2O2處理的HLECs ERβ表達(dá)的影響

FCM檢測結(jié)果顯示(表2、圖2):正常HLECs存在ERβ的表達(dá);H2O2組HLECs內(nèi)ERβ表達(dá)明顯下降，與對照組比較有顯著差異(P＜0.01);E2、ISR高中低濃度組的 HLECs內(nèi) ERβ表達(dá)明顯升高，與H2O2組比較有顯著差異(P＜0.01);且隨ISR濃度的增高HLECs內(nèi)ERβ表達(dá)逐漸升高，呈明顯的濃度依賴關(guān)系。

表2 FCM檢測不同濃度ISR對經(jīng)H2O2處理的HLECs ERβ表達(dá)的影響Table 2.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERβ of HLECs incubated with H2O2(.n=6)

表2 FCM檢測不同濃度ISR對經(jīng)H2O2處理的HLECs ERβ表達(dá)的影響Table 2.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERβ of HLECs incubated with H2O2(.n=6)

＊＊P ＜ 0.01 vs control group;▲▲P ＜0.01 vs H2O2group.

Group ERβ(%)Control 27.208 ±1.633 H2O2 15.702 ±0.613＊＊E2 25.478 ±0.906▲▲ISR(10 －5mol/L) 29.950 ±4.526▲▲ISR(10 －6mol/L) 26.120 ±2.801▲▲ISR(10－7mol/L)18.025 ±0.540

Figure 2.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERβ in H2O2－treated HLECs examined by flow cytometry圖2 FCM檢測不同濃度ISR對經(jīng)H2O2處理的HLECs ERβ表達(dá)的影響

討 論

氧化損傷是誘發(fā)老年性白內(nèi)障形成的一個重要因素，如各種原因和途徑導(dǎo)致的晶狀體氧自由基產(chǎn)生過多或清除過少，均可引起HLECs和纖維組織的損傷而導(dǎo)致老年性白內(nèi)障的發(fā)生。

ER是類固醇激素受體超大家族中的一員，人體內(nèi)有2種雌激素受體，即ERα和ERβ。雌激素的生物效應(yīng)主要是通過與ER結(jié)合而發(fā)揮作用［4］。已有相關(guān)研究結(jié)果證實了HLECs上有ER的表達(dá)，并在亞細(xì)胞器上的定位進(jìn)行了研究［5－7］。本研究結(jié)果表明:正常HLECs上存在ERα、β表達(dá)，與國內(nèi)外學(xué)者的報道結(jié)果一致。國外學(xué)者報道了氧化損傷能影響ERα、β的表達(dá)［8］。本研究表明:H2O2能下調(diào)HLECs的ERα、β表達(dá)，提示由H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷參與的老年性白內(nèi)障可能與HLECs的ERα、β下調(diào)有關(guān)。

近年來有相關(guān)文獻(xiàn)報道了E2對氧化損傷的HLECs的保護(hù)作用:Wang等［9］的研究結(jié)果表明了E2對體外培養(yǎng)的HLECs氧化應(yīng)激的保護(hù)效應(yīng):將HLECs暴露于H2O2可引起細(xì)胞生存力、胞內(nèi)ATP水平和線粒體膜電位三者呈劑量依賴性下降;而用E2預(yù)處理的HLECs，前兩者均呈劑量依賴性提高，此研究首次在HLECs中證實雌激素具有抗氧化作用。Moor等［10，11］研究發(fā)現(xiàn) E2在保護(hù) HLECs免受氧化損傷中，穩(wěn)定線粒體膜電位起了關(guān)鍵作用;在H2O2處理的HLECs中，E2誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化與穩(wěn)定線粒體膜電位呈正相關(guān)，故可能在E2活化MAPK信號通路與穩(wěn)定線粒體膜電位來發(fā)揮17β－E2的抗氧化、細(xì)胞保護(hù)作用的能力之間存在聯(lián)系，這可能是E2抗氧化的機(jī)制之一。Flynn等［12］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):在高糖條件下培養(yǎng)的牛HLECs持續(xù)產(chǎn)生多羥化合物，多羥化合物的聚集促進(jìn)線粒體膜去極化，預(yù)先用E2處理HLECs可阻止線粒體膜電位的增加，對抗線粒體膜去極化。Gottipati等［13］的研究表明，E2可快速活化HLECs線粒體相關(guān)的錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)而不影響其 mRNA和蛋白的表達(dá)，推測MnSOD可能在對抗線粒體氧化損傷過程中發(fā)揮了重要作用。

E2通過受體發(fā)揮其生物學(xué)效用，在各種不同細(xì)胞上對ER的上調(diào)或下調(diào)作用［14，15］。ISR是中藥植物雌激素，已有報道ISR可使人乳腺癌T47D細(xì)胞的ERα mRNA表達(dá)顯著增加，同時也可使ERβ mRNA表達(dá)增加［14］。本研究表明:E2、ISR能上調(diào)經(jīng) H2O2處理的HLECs的ER表達(dá)，并呈明顯的濃度依賴關(guān)系，提示E2、ISR可能通過上調(diào)經(jīng)H2O2處理HLECs的ER表達(dá)來發(fā)揮抗氧化損傷作用，從而起到防治老年性白內(nèi)障的作用。該結(jié)果將為開發(fā)防治老年性白內(nèi)障的有效藥物提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

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