朱穎婷， 鄧新國， 高 楊， 何梅鳳， 李 娜

(中山大學(xué)中山眼科中心，中山大學(xué)眼科學(xué)國家重點實驗室，廣東 廣州 510060)

遺傳性視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一組常見的遺傳性、致盲性視網(wǎng)膜疾病，以視網(wǎng)膜光感受器和色素上皮功能進行性受損為主要特征［1］。目前實驗證明該病的發(fā)病機制與視桿細胞和視錐細胞相繼死亡有關(guān)［2，3］。一般情況下，視桿細胞先死亡，繼發(fā)引起視錐細胞死亡，可能的原因如下:視桿細胞死亡后釋放毒性物質(zhì);激活小膠質(zhì)細胞釋放毒性物質(zhì)的直接作用;視桿細胞死亡后，無法提供視錐細胞生存必須的營養(yǎng)物質(zhì);視桿細胞死亡后，脈絡(luò)膜血管氧供給量不變，導(dǎo)致視網(wǎng)膜氧超載。

常用于研究視網(wǎng)膜色素變性的動物模型有如下幾種，包括rd小鼠、rds小鼠和RCS大鼠等遺傳性動物模型;RPE－65基因敲除、視紫紅質(zhì)(rhodopson)基因敲除和P23H基因突變等轉(zhuǎn)基因鼠模型;光照損傷所致的大、小鼠視網(wǎng)膜變性動物模型;以及致突變劑N－甲基－N－亞硝脲(N－methyl－N－nitrosourea，MNU)［4］和碘酸鈉所致視網(wǎng)膜變性動物模型。以上動物模型主要涉及視網(wǎng)膜外核層的光感受器細胞損傷或視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)損傷。

碘酸鈉誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素變性模型的特點是，選擇性地引起RPE損傷，繼而導(dǎo)致視網(wǎng)膜光感受器細胞等組織的損傷［5］。目前國內(nèi)外的研究多集中于其造成的形態(tài)學(xué)改變及功能學(xué)改變［6］，但對其造成的氧化損傷機制未見報道。氧化應(yīng)激是視網(wǎng)膜損傷過程中的重要機制之一，本實驗意在通過檢測碘酸鈉造模后視網(wǎng)膜超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)的活性，探討碘酸鈉誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素變性的氧化損傷機制。

材料和方法

1 材料

1.1 主要儀器和試劑 冰凍切片機(Leica，CM1850)、倒置顯微鏡(Carl Zeiss)、UV－1700分光光度計(日本島津)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(榮華儀器制造有限公司)、組織粉碎機(廣州展晨生物科技公司)，臺式低速自動平衡離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)。SOD、CAT試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 實驗動物及分組 SPF級SD大鼠80只，5周齡，體重80－100 g，雄性，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。隨機分為4組，分別為40 mg/kg、50 mg/kg、60 mg/kg碘酸鈉造模組和正常對照組。造模組經(jīng)尾靜脈注射不同劑量的碘酸鈉(20 g/L)，正常對照組經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水。本研究中所用的實驗方法均嚴格按照ARVO關(guān)于實驗動物使用規(guī)定進行。

2.2 病理學(xué)檢查及損傷程度分級 采用氯胺酮過量麻醉法處死大鼠，完整摘除右眼球，每組3只眼球采用4%甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟包埋，切片染色觀察;另外2只眼球采用4%多聚甲醛固定2 h、12.5%蔗糖脫水1 h、30%蔗糖脫水1 h，進行冰凍切片后，HE染色觀察。

2.3 病理學(xué)評分 根據(jù)碘酸鈉所致視網(wǎng)膜色素上皮和外核層細胞損傷的程度制定以下評級標準，并轉(zhuǎn)化為數(shù)字，進行統(tǒng)計學(xué)計算:0級(0分):視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)正常;1級(1分):色素上皮層損傷，外核層排列輕度紊亂或外核層波浪狀改變占視網(wǎng)膜全長≤1/5，外核層厚度減少不明顯;2級(2分):色素上皮層損傷，外核層排列紊亂，外核層波浪狀改變占視網(wǎng)膜全長≤2/5，外核層厚度減少不明顯;3級(3分):色素上皮層損傷，外核層排列紊亂，外核層波浪狀改變占視網(wǎng)膜全長≤4/5，外核層厚度減少≤1/2;4級(4分):色素上皮層增厚，外核層排列紊亂，外核層波浪狀改變占視網(wǎng)膜全長≤4/5，外核層厚度減少＞1/2。

2.4 SOD、CAT水平的測定 完整摘除左眼球，全層鈍性分離視網(wǎng)膜組織，稱重后用生理鹽水配成5%組織懸液，冰浴勻漿10000 r/min離心3 min后3000 r/min離心15 min，取出上清液。根據(jù)南京建成生物工程研究所試劑說明書提供的方法，應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法對SOD活性進行測定，于波長550 nm處檢測;應(yīng)用鉬酸銨終止法對CAT活性進行測定，于波長405 nm處檢測。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示。病理學(xué)評分采用秩和檢驗(Kruskal－Wallis test)，SOD和CAT活性采用方差分析(one－way ANOVA)比較組間差異。

結(jié) 果

1 不同劑量碘酸鈉誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜色素變性的病理損傷程度變化

統(tǒng)計結(jié)果顯示，與正常對照組相比，60 mg/kg碘酸鈉造模組第1 d，40 mg/kg和50 mg/kg碘酸鈉造模組第4 d，大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞或外核層細胞出現(xiàn)明顯的病理損傷(P＜0.05或P＜0.01);各劑量組4 d、7 d、14 d的病理損傷均比1 d時要重，差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)，見表1、圖1。

2 不同劑量碘酸鈉誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素變性的視網(wǎng)膜組織SOD、CAT測定結(jié)果

與對照組相比，造模1 d和4 d，60 mg/kg碘酸鈉造模組SOD活性明顯下降(P＜0.01);造模7 d和14 d，各劑量組SOD活性均明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)果表明，40 mg/kg、50 mg/kg和60 mg/kg碘酸鈉在7 d后均可誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜SOD活性降低，見表2。

表1 不同劑量碘酸鈉在不同時點誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜病理損傷程度的比較Table 1.The comparison of the levels of retinal pathological damage of the model rats indcued by different doses of sodium iodate at different times(.n=5)

表1 不同劑量碘酸鈉在不同時點誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜病理損傷程度的比較Table 1.The comparison of the levels of retinal pathological damage of the model rats indcued by different doses of sodium iodate at different times(.n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs 1 d group.

Group 1 d 4 d 7 d 14 d Control 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 NaIO340 mg/kg 0.00±0.00 1.80±0.49＊△ 1.67±0.61＊△ 1.60±0.60＊△NaIO350 mg/kg 0.40±0.24 2.00±0.44＊＊ 2.33±0.33＊＊△△ 3.00±0.32＊＊△△NaIO360 mg/kg0.80±0.20* 2.60±0.40＊＊△ 2.50±0.34＊＊△ 3.20±0.34＊＊△△

表2 不同劑量碘酸鈉在不同時點誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜色素變性的視網(wǎng)膜組織SOD的比較Table 2.The comparison of SOD activity in the retina tissues of model rats induced by different doses of sodium iodate at different time

Figure 1.Retinal pathological damage induced by different doses of sodium iodate at different time in rats.A:retinal pathological damage in control group;B，E，H，K:retinal pathological damage at the dosage of 40 mg/kg sodium iodate on day 1，4，7 and 14 respectively;C，F(xiàn)，I，L:retinal pathological damage at the dosage of 50 mg/kg sodium iodate on day 1，4，7 and 14;D，G，J，M:retinal pathological damage at the dosage of 60 mg/kg sodium iodate on day 1，4，7 and 14;D:the reduction of retinal pigment epithelial cells and the disorder of retinal photoreceptor arrangement;E－M:damage of retinal pigment epithelial cells，waveform appearance in retinal out nuclear layer and decrease of photoreceptor nuclear.The damage in retina was more severe following the increasing doses and time of sodium iodate.圖1 不同劑量碘酸鈉在不同時點誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜病理損傷

與對照組相比，造模1 d和4 d，60 mg/kg碘酸鈉造模組CAT活性明顯下降(P＜0.05);造模7 d和14 d，各劑量組CAT活性均明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)果表明，40 mg/kg、50 mg/kg和60 mg/kg碘酸鈉在7 d后均可誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜CAT活性降低，見表3。

討 論

碘酸鈉是一種無機氧化劑，超大劑量碘酸鈉(100 mg/kg)能在6 h后造成視網(wǎng)膜色素上皮細胞壞死和24 h后外核層細胞排列紊亂和凋亡［5］。多數(shù)學(xué)者常用40－60 mg/kg碘酸鈉進行實驗，均可誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜色素上皮和光感受器細胞損傷。我們選用40 mg/kg、50 mg/kg和60 mg/kg碘酸鈉進行實驗，在第1、4、7和14 d觀察視網(wǎng)膜的變化，結(jié)果顯示，60 mg/kg碘酸鈉造模組第1 d，40 mg/kg和50 mg/kg碘酸鈉造模組第4 d，大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞或外核層細胞出現(xiàn)明顯的病理損傷，視網(wǎng)膜色素上皮細胞在最初的損傷中，細胞數(shù)減少，繼而完全丟失;視網(wǎng)膜外核層在最初的損傷中出現(xiàn)細胞排列紊亂和輕度的波浪狀改變，隨時間的增加，這種改變加重，且外核層細胞減少明顯，外核層變薄。碘酸鈉的用量越大，成模越早，損傷越重。我們的結(jié)果與其它文獻報導(dǎo)的結(jié)果相似［5－8］。

表3 不同劑量碘酸鈉在不同時點誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜色素變性的視網(wǎng)膜組織CAT的比較Table 3.The comparison of CAT activity in the retina tissues of model rats induced by different doses of sodium iodate at different time

本實驗根據(jù)病理檢查結(jié)果，為碘酸鈉誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素變性的病理結(jié)構(gòu)改變制訂了一種分級評分標準。從研究結(jié)果可見，該評分標準能反映碘酸鈉誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病理改變的病程綜合變化，而不是散在地觀察各個結(jié)構(gòu)的損傷，這樣更有利于判斷視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)損傷的程度，可為今后造模劑量和時間的選擇以及治療效果的評價提供有效參考。

氧化應(yīng)激是指機體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除失衡，導(dǎo)致活性氧在體內(nèi)堆積產(chǎn)生毒性，引起多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化(lipid peroxidation，LPO)反應(yīng)，從而導(dǎo)致組織損傷的過程。視細胞外節(jié)是體內(nèi)含長鏈不飽和脂肪酸最高的組織，這些不飽和脂肪酸具有易受自由基攻擊的亞甲基結(jié)構(gòu)，易與·OH發(fā)生LPO反應(yīng)。在視網(wǎng)膜色素變性中，缺乏自調(diào)機制的脈絡(luò)膜血管供氧過多［9］、NO引起的過氧化亞硝酸鹽增多［10，11］等都能導(dǎo)致視網(wǎng)膜細胞的氧化應(yīng)激損傷，直接損傷細胞中的蛋白和DNA等大分子物質(zhì)。

而SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能通過歧化反應(yīng)清除超氧陰離子自由基(O－·2)保護細胞免受損傷。CAT則通過另外一種途徑清除氧化自由基，它使過氧化氫(H2O2)還原為H2O，阻止羥自由基(·OH)的生成，并可終止自由基鏈反應(yīng)。外源性SOD和CAT作為抗氧化酶已被證明對視網(wǎng)膜的保護作用［12］，而內(nèi)源性共同表達SOD2和CAT也能顯著減緩視網(wǎng)膜色素變性中視錐細胞的死亡［13］。碘酸鈉的氧化作用與IO－3有關(guān)［14］，抗氧化系統(tǒng)的損傷加速脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，從而可導(dǎo)致細胞重要的蛋白和DNA受到破壞［15］，細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，甚至損傷和死亡。

從本實驗生化檢測結(jié)果可知，在短時間內(nèi)，只有較大劑量的碘酸鈉對視網(wǎng)膜組織的抗氧化系統(tǒng)造成了損傷，而較小劑量碘酸鈉對視網(wǎng)膜組織SOD和CAT的影響只在較長時間后顯現(xiàn)出來。在各時點，造模組視網(wǎng)膜組織SOD與CAT水平的下降存在劑量依賴性，這與其結(jié)構(gòu)損傷的趨勢是類似的。說明碘酸鈉對視網(wǎng)膜的損傷存在劑量依賴性，氧化應(yīng)激損傷是碘酸鈉誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素變性的機制之一，而SOD和CAT在視網(wǎng)膜抗氧化系統(tǒng)中起著重要的作用。

［1］Kalloniatis M，F(xiàn)letcher EL.Retinitis pigmentosa:understanding the clinical presentation，mechanism and treatment options［J］.Clin Exp Optom，2004，87(2):65－80.

［2］Ripps H.Cell death in retinitis pigmentosa:Gap junction and the‘bystander’effect［J］.Exp Eye Res，2002，74(3):327－336.

［3］Leverillard T，Mohand －Said S，Lorentz O，et al.Identification and characterization of rod－derived viability factor［J］.Nat Genet，2004，36(7):755 －759.

［4］鄧新國，葛 堅，何梅風，等.不同MNU劑量誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞損傷的視網(wǎng)膜電圖和病理形態(tài)的改變［J］.中國病理生理雜志，2008，24(4):828－832.

［5］Kiuchi K，Yoshizawa K，Shikata N，et al.Morphologic characteristics of retinal degeneration induced by sodium iodate in mice［J］.Curr Eye Res，2002，25(6):373 －379.

［6］Enzmann V，Row BW，Yamauchi Y，et al.Behavioral and anatomical abnormalities in a sodium iodate－induced model of retinal pigment epithelium degeneration［J］.Exp Eye Res，2006，82(3):441 －448.

［7］Gong LH，Wu Q，Song B，et al.Differentiation of rat mesenchymal stem cells transplanted into the subretinal space of sodium iodate － injected rats［J］.Clin Exp Ophthalmol，2008，36(7):666 －671.

［8］Ohtaka K，Machida S，Ohzeki T，et al.Protective effect of hepatocyte growth factor against degeneration of the retinal pigment epithelium and photoreceptor in sodium iodate－ injected rats［J］.Curr Eye Res，2006，31(4):347 －355.

［9］Komeima K，Rogers BS，Campochiaro PA.Antioxidants slow photoreceptor cell death in mouse models of metinitis pigmentosa［J］.J Cell Physiol，2007，213(3):809 －815.

［10］Komeima K，Usui S，Shen J，et al.Blockade of neuronal nitric oxide synthase reduces cone cell death in a model of retinitis pigmentosa［J］.Free Radic Biol Med，2008，45(6):905－912.

［11］Sanz MM，Johnson LE，Ahuja S，et al.Significant photoreceptor rescue by treatment with a combination of antioxidants in an animal model for retinal degeneration［J］.Neuroscience，2007，145(3):1120 －1129.

［12］王雨生，嚴 密，彭文珍.可見光對培養(yǎng)的人RPE細胞生長的影響以及SOD和CAT的防護作用［J］.中華眼底病雜志，1996，12(4):230－232.

［13］Usui S，Komeima K，Lee SY，et al.Increased expression of catalase and superoxide dismutase 2 reduces cone cell death in retinitis pigmentosa［J］.Mol Ther，2009，17(5):778－786.

［14］黃文金，陳志輝.碘酸鹽的毒理學(xué)研究進展［J］.海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2002，8(1):79－80.

［15］Shen J，Yang X，Dong A，et al.Oxidative damage is a pothential cause of cone cell death in retinitis pigmentosa［J］.J Cell Physiol，2005，203(3):457 －464.