張 彬， 肖獻(xiàn)忠， 張文輝， 蔣 磊， 蔣碧梅△

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院1病理生理學(xué)系，2組織學(xué)與胚胎學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙 410078)

革蘭氏陰性細(xì)菌胞壁上的LPS(lipopolysaccharide，LPS)即內(nèi)毒素，是引起膿毒癥(sepsis)的主要原因之一。當(dāng)機(jī)體遭遇革蘭氏陰性細(xì)菌感染時(shí)，LPS釋放入血，與血漿中的LPS結(jié)合蛋白(LPS binding protein，LBP)形成復(fù)合物，由LBP運(yùn)送至單核－巨噬細(xì)胞及多形核白細(xì)胞膜表面的白細(xì)胞分化抗原14(cluster of differentiation 14，CD14)受體，然后通過(guò)跨膜信號(hào)受體 Toll樣受體 4(Toll like recept 4，TLR4)等將LPS信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞，激活細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而啟動(dòng)炎癥介質(zhì)的表達(dá)如白細(xì)胞介素1β(interleukin－1β，IL －1β)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor－ α，TNF － α)［1］。核仁素(nucleolin，由C23基因編碼)是一種具有多種生物學(xué)功能的RNA結(jié)合蛋白，在核仁的發(fā)生、核糖體的生物合成與成熟、細(xì)胞增殖與生長(zhǎng)及細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用［2，3］。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌感染人THP－1單核細(xì)胞時(shí)伴有核仁素表達(dá)上調(diào);LPS誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞活化時(shí)伴有核仁素裂解片段的表達(dá)下調(diào)［4，5］。這些證據(jù)表明，核仁素可能在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。但是發(fā)揮何種作用以及如何起作用，目前仍不清楚。因此，本研究首先以內(nèi)毒素血癥小鼠和內(nèi)毒素刺激的巨噬細(xì)胞為模型，探討核仁素在炎癥中的表達(dá)，并采用基因轉(zhuǎn)染、反義寡核苷酸技術(shù)從正反兩方面深入探討核仁素對(duì)LPS所致細(xì)胞炎癥因子分泌的影響，從而為進(jìn)一步探討核仁素在炎癥反應(yīng)中的作用奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

BALB/c小鼠由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。正常RAW264.7細(xì)胞 (小鼠巨噬細(xì)胞)，貼壁生長(zhǎng)，由本校細(xì)胞中心提供。pcDNA3.1－C23真核表達(dá)載體由本科室王海云碩士構(gòu)建。鼠抗核仁素單克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz;GAPDH小鼠單克隆抗體購(gòu)于中國(guó)康成公司;鼠IL－1β ELISA試劑盒購(gòu)于Boster;Lipofectamine脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen;大腸桿菌LPS(E.coli O111∶B4)購(gòu)自 Sigma。

2 方法

2.1 細(xì)胞株傳代培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞(小鼠巨噬細(xì)胞)用含10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。將細(xì)胞放置于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約85% 的融合狀態(tài)用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 C23反義寡核苷酸的設(shè)計(jì) 從GenBank獲得小鼠C23基因全長(zhǎng)cDNA，GenBank號(hào)為BC005460，選擇跨越起始密碼子的6－9位點(diǎn)作為靶位點(diǎn)，由堿基互補(bǔ)原則設(shè)計(jì)并合成正義(S)、反義(AS)及隨機(jī)(R)寡核苷酸。S:5'－CATGGTGAAGCTCGCAAAGGCTGGC－3';AS:5'－GCCAGCCTTTGCGAGCTTCACCATG－3';R:5'－CTACGAGACTGCCTCCACTGCTTCG－3';并將所有堿基進(jìn)行硫代修飾。

2.3 pcDNA3.1－C23或C23反義寡核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞 根據(jù)Invitrogen公司提供的轉(zhuǎn)染操作說(shuō)明書進(jìn)行。具體步驟如下:以合適的細(xì)胞密度接種到6孔培養(yǎng)板上(接種密度是3×108cells/L)，待細(xì)胞達(dá)到80%－85%的融合狀態(tài)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將20 μg pcDNA3.1 －C23 DNA 或20 μg C23 反義寡核苷酸稀釋于480 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中，室溫下置5 min。將15 μL脂質(zhì)體稀釋于485 μL的無(wú)血清培養(yǎng)基中，室溫下置5 min。然后將兩者混合，室溫下置20 min。將6孔板中的細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞2遍后，加入2 mL無(wú)血清培養(yǎng)基。將上述混合液逐滴加入孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37℃、5%CO2中培養(yǎng)6 h。6 h后，更換含有血清的全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2中培養(yǎng)24 h。

2.4 免疫印跡法(Western blotting) 按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行。用2×SDS裂解緩沖液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞總蛋白質(zhì)，100℃煮沸10 min，12000 r/min離心10 min，收集上清。采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，制備好的蛋白樣品置－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?0 g蛋白經(jīng)10% －12%SDS－PAGE電泳6 h后，電轉(zhuǎn)(4℃，過(guò)夜)至硝酸纖維素膜，2%BSA室溫封閉3 h，先后加入靶蛋白抗體及HRP標(biāo)記的相應(yīng)IgG，室溫分別孵育1 h和0.5 h，DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 用LPS處理轉(zhuǎn)染pcDNA3.1－C23表達(dá)載體或C23反義寡核苷酸的細(xì)胞，在相應(yīng)時(shí)點(diǎn)收集細(xì)胞培養(yǎng)基，按試劑盒說(shuō)明操作，檢測(cè)IL－1β量的變化。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 BALB/c小鼠內(nèi)毒素血癥模型中核仁素表達(dá)的變化

小鼠內(nèi)毒素血癥模型按照本實(shí)驗(yàn)室的成熟方法建立。BALB/c小鼠經(jīng)腹腔注射LPS(15 mg/kg)，分別于6 h、12 h、24 h提取肺組織總蛋白，用 Western blotting檢測(cè)不同時(shí)點(diǎn)核仁素的表達(dá)改變。結(jié)果顯示(圖1):與對(duì)照組相比，LPS注射6 h后110 kD核仁素全長(zhǎng)分子表達(dá)上調(diào)，12 h達(dá)到最高并維持到24 h;80 kD的核仁素片段則于注射LPS 6 h后表達(dá)下調(diào)，持續(xù)至24 h。

2 核仁素在RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中的表達(dá)改變

用500 μg/L LPS處理 RAW264.7 細(xì)胞，分別于6 h、12 h、24 h、36 h 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，通過(guò)Western blotting分析不同時(shí)點(diǎn)核仁素的表達(dá)改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖2):與未處理組比較，110 kD核仁素全長(zhǎng)分子在LPS處理6 h后表達(dá)上調(diào)，12 h上調(diào)最明顯并維持到36 h;而80 kD的核仁素片段在LPS處理后逐漸減少。

Figure 1.Western blotting showed the level of 110 kD nucleolin was increased and the level of 80 kD nucleolin was decreased in the lung tissues of the mice treated with 15mg/kg of LPS at different time..n=3.*P＜0.05 vs control group.圖1 Western blotting檢測(cè)小鼠內(nèi)毒素血癥不同時(shí)點(diǎn)肺組織中核仁素的表達(dá)

Figure 2.Western blotting showed the level of 110 kD nucleolin was increased and the level of 80 kD nucleolin was decreased in RAW264.7 cells treated with 500 μg/L LPS at different time..n=3.*P＜0.05 vs control group.圖2 Western blotting檢測(cè)LPS刺激下不同時(shí)點(diǎn)RAW264.7細(xì)胞中核仁素的表達(dá)

3 用生物信息學(xué)方法篩選可能受核仁素調(diào)控的炎癥介質(zhì)基因

采用生物信息學(xué)方法分析，發(fā)現(xiàn)TNF－α、IL－1α、IL－1β等多個(gè)炎癥介質(zhì)基因的mRNA分子中含有完整的核仁素結(jié)合元件，見表1，表明上述多個(gè)基因mRNA穩(wěn)定性可能直接受核仁素調(diào)控。

表1 mRNA中含有核仁素結(jié)合元件的炎癥介質(zhì)基因Table 1.Inflammatory mediator genes containing nucleolinbinding element

4 轉(zhuǎn)核仁素真核表達(dá)載體后RAW264.7細(xì)胞中核仁素的表達(dá)改變

用全長(zhǎng)核仁素真核表達(dá)載體(pcDNA3.1－C23)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)Western blotting檢測(cè)核仁素的表達(dá)改變。結(jié)果顯示(圖3):與轉(zhuǎn)空載體組比較，轉(zhuǎn)全長(zhǎng)核仁素真核表達(dá)載體組細(xì)胞中110 kD核仁素表達(dá)明顯上調(diào)。

Figure 3.Western blotting showed the level of 110 kD nucleolin was increased in RAW264.7 cells transfected with pcDNA3.1－C23..n=3.*P＜0.05 vs pcDNA3.1 group.圖3 Western blotting檢測(cè)核仁素基因轉(zhuǎn)染后RAW264.7細(xì)胞中核仁素的表達(dá)

5 核仁素過(guò)表達(dá)對(duì)LPS所致RAW264.7細(xì)胞IL－1β釋放的影響

用核仁素真核表達(dá)載體(pcDNA3.1－C23)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞24 h，經(jīng)LPS處理后，分別于6 h、12 h、24 h收集上清，采用 ELISA 檢測(cè) IL－1β 的變化。結(jié)果顯示:核仁素過(guò)表達(dá)對(duì)LPS所致IL－1β釋放有促進(jìn)作用，見圖4。

Figure 4.ELISA showed nucleolin－overexpression promoted LPS－ induced IL －1β release in RAW264.7 cells..n=5.*P＜0.05 vs pcDNA3.1 group.圖4 ELISA顯示核仁素過(guò)表達(dá)對(duì)LPS所致RAW264.7細(xì)胞IL－1β釋放的影響

6 核仁素反義寡核苷酸對(duì)RAW264.7細(xì)胞中核仁素的表達(dá)改變

用核仁素反義寡核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)Western blotting檢測(cè)核仁素的表達(dá)改變。結(jié)果顯示(圖5):與正常組比較，轉(zhuǎn)脂質(zhì)體或隨機(jī)寡核苷酸組的核仁素變化不明顯，而轉(zhuǎn)核仁素反義寡核苷酸組的110 kD核仁素表達(dá)明顯受到抑制。

7 核仁素低表達(dá)對(duì)LPS所致RAW264.7細(xì)胞IL－1β釋放的影響

用核仁素反義寡核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞24 h，于LPS 處理后的6 h、12 h、24 h 收集上清，采用ELISA檢測(cè)IL－1β的變化。結(jié)果顯示:LPS處理后IL－1β釋放明顯增加;但核仁素低表達(dá)抑制了LPS所致的IL－1β釋放，見圖6。

討 論

Figure 5.Western blotting showed the level of 110 kD nucleolin was decreased in RAW264.7 cells transfected with antisense oligonucleotide of nucleolin..n=3.*P＜0.05 vs control group.Lip:lipofectamine;R:random oligonucleotide;AS:antisense oligonucleotide.圖5 Western blotting檢測(cè)核仁素反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對(duì)RAW264.7細(xì)胞中核仁素表達(dá)的影響

Figure 6.ELISA showed nucleolin－deficiency suppressed LPS－induced IL－1β release in RAW264.7..n=5.*P ＜0.05 vs control group.ScrODNs:scramble oligonucleotides;AsODNs:antisense oligonucleotides.圖6 ELISA分析核仁素低表達(dá)對(duì)LPS所致RAW264.7細(xì)胞IL－1β釋放的影響

LPS通過(guò)激活多條信號(hào)通路促進(jìn)體內(nèi)炎癥介質(zhì)的過(guò)表達(dá)，在膿毒癥發(fā)病中起著重要的作用。最近研究表明核仁素可能在炎癥中起作用。故本實(shí)驗(yàn)擬從整體和細(xì)胞水平初步探討核仁素在LPS所致炎癥反應(yīng)中的作用。研究發(fā)現(xiàn)LPS處理后，小鼠肺組織以及RAW264.7細(xì)胞中核仁素110 kD片段表達(dá)上調(diào)，而80 kD片段在LPS處理后逐漸減少。這結(jié)果提示，LPS所致小鼠內(nèi)毒素血癥模型及細(xì)胞炎癥模型中伴有核仁素的表達(dá)改變。但核仁素的表達(dá)改變?cè)贚PS所致炎癥模型中是伴隨現(xiàn)象還是起了重要作用，仍需要進(jìn)一步研究。

核仁素是一種RNA結(jié)合蛋白，能與含－(T/G)CCCG(A/G)－序列的 rRNA特異性結(jié)合［6］。近年發(fā)現(xiàn)核仁素還可作為反式作用因子與多個(gè)基因的mRNA分子中的－(T/G)CCCG(A/G)–序列的順式作用元件相結(jié)合來(lái)調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性，從而調(diào)控基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。Zhang等［7］發(fā)現(xiàn)核仁素可與生長(zhǎng)抑制和DNA損傷誘導(dǎo)基因45α(growth arrest and DNA damage inducible gene 45α，GADD45α)mRNA結(jié)合來(lái)調(diào)控 GADD45α mRNA的穩(wěn)定性。Chen等［8］發(fā)現(xiàn)核仁素可與IL－2 mRNA 的5＇－非翻譯區(qū)(5＇－untranslated region，5＇－UTR)相結(jié)合，增加其穩(wěn)定性，使 IL－2蛋白表達(dá)增高;Singh等［9］發(fā)現(xiàn)核仁素可通過(guò)RNA/蛋白質(zhì)相互作用，增加CD154 mRNA的穩(wěn)定性。這些研究結(jié)果提示，核仁素可與炎癥介質(zhì)基因的mRNA結(jié)合，從而調(diào)控其穩(wěn)定性及表達(dá)。

通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn) IL－1β、IL－1α、TNF－α等多個(gè)炎癥介質(zhì)基因的mRNA分子中含有完整的核仁素結(jié)合元件(表1)。表明核仁素有可能通過(guò)與這些炎癥介質(zhì)基因的mRNA結(jié)合而調(diào)控它們的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)炎癥反應(yīng)起調(diào)控作用。IL－1β是LPS所致炎癥反應(yīng)中的重要早期促炎介質(zhì)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。為了探討核仁素是否對(duì)IL－1β起調(diào)控作用，我們采用了核仁素真核表達(dá)載體及反義寡核苷酸，發(fā)現(xiàn)RAW264.7細(xì)胞中核仁素過(guò)表達(dá)后可促進(jìn)LPS所致IL－1β的釋放，低表達(dá)則抑制LPS所致IL－1β的釋放。上述結(jié)果提示，RAW264.7細(xì)胞中核仁素的表達(dá)水平對(duì)LPS所致IL－1β的釋放有明顯的影響。但該影響是否通過(guò)核仁素與IL－1β mRNA結(jié)合，使IL－1 βmRNA穩(wěn)定性增加而導(dǎo)致IL－1β表達(dá)增多，進(jìn)而釋放增多，則仍需進(jìn)一步的研究闡明。

［1］Seimon TA，Obstfeld A，Moore KJ，et al.Combinatorial pattern recognition receptor signaling alters the balance of life and death in macrophages［J］.Proc NatI Acad Sci USA，2006，103(52):19794 －19799.

［2］Ginisty H，Sicard H，Roger B，et al.Structure and functions of nucleolin［J］.J Cell Sci，1999，112(Pt 6):761－772.

［3］Mi Y，Thomas SD，Xu X，et al.Apoptosis in leukemia cells is accompanied by alterations in the levels and localization of nucleolin［J］.J Biol Chem，2003，278(10):8572－8579.

［4］Saba JA，McComb ME，Potts DL，et al.Proteomic mapping of stimulus－specific signaling pathways involved in THP－1 cells exposed to Porphyromonas gingivalis or its purified components［J］.J Proteome Res，2007，6(6):2211－2221.

［5］Zhang X，Kuramitsu Y，F(xiàn)ujimoto M，et al.Proteomic analysis of macrophages stimulated by lipopolysaccharide:lipopolysaccharide inhibits the cleavage of nucleophosmin［J］.Electrophoresis，2006，27(8):1659 －1668.

［6］Bouvet P，Allain FH，F(xiàn)inger LD，et al.Recognition of pre－formed and flexible elements of an RNA stem－loop by nucleolin［J］.J Mol Biol，2001，309(3):763 －775.

［7］Zhang Y，Bhatia D，Xia H，et al.Nucleolin links to arsenic－induced stabilization of GADD45α mRNA［J］.Nucleic Acids Res，2006，34(2):485 －495.

［8］Chen CY，Gherzi R，Andersen JS，et al.Nucleolin and YB－1 are required for JNK－mediated interleukin－2 mRNA stabilization during T － cell activation［J］.Genes Dev，2000，14(7):1236 －1248.

［9］Singh K，Laughlin J，Kosinski PA，et al.Nucleolin is a second component of the CD154 mRNA stability complex that regulates mRNA turnover in activated T cells［J］.J Immunol，2004，173(5):976 －985.