程莉莉，劉麗君，林 浩，唐曉飛，魏 崍，吳廣錫，楊 吉吉，張 穎

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所，哈爾濱 150086；3.黑龍江省菽錦科技有限責(zé)任公司，哈爾濱 150086）

玉米是我國(guó)重要的糧食和飼料作物[1]，玉米生產(chǎn)在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位。玉米種質(zhì)資源包括各類地方品種、綜合種、復(fù)合種、雜交種、中間材料、自交系及玉米野生近緣種等，是玉米生產(chǎn)、利用和新品種選育的物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。玉米種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)狹窄一直是限制我國(guó)玉米育種發(fā)展的重要因素[3]，研究種質(zhì)的遺傳多樣性對(duì)玉米育種和種質(zhì)利用與保護(hù)具有重要的指導(dǎo)意義[4]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)為種質(zhì)遺傳多樣性研究提供了新手段和新方法[1]。目前，各種分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于玉米遺傳多樣性的研究中。鄭得剛等利用SSR標(biāo)記技術(shù)研究了黑龍江省常用玉米自交系的遺傳多樣性，并將玉米種質(zhì)歸納為Reid和非Reid兩大類[5]；杜金友等利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)55份玉米種質(zhì)材料進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，AFLP有利于玉米遺傳多樣性分析[6]；Mumm等在采用46個(gè)探針酶的RFLPs基礎(chǔ)上聚類分析了美國(guó)148個(gè)玉米自交系，并將材料進(jìn)行了類群的劃分[7]；黃世全等通過RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)16個(gè)玉米自交系進(jìn)行遺傳多樣性和聚類分析，其聚類分析結(jié)果與系譜分析大體相似[8]；姜樹坤等利用一種基于PCR的新型標(biāo)記技術(shù)SRAP標(biāo)記對(duì)16個(gè)玉米自交系進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明SRAP標(biāo)記是一種適合于玉米遺傳多樣性研究的分子標(biāo)記[9]。

本研究采用具有方法簡(jiǎn)單、多態(tài)性好、可靠性高等優(yōu)點(diǎn)的SSR分子標(biāo)記技術(shù)[10]，對(duì)383份玉米材料進(jìn)行遺傳多樣性研究，利用UPGMA方法對(duì)材料進(jìn)行聚類分析，進(jìn)行優(yōu)勢(shì)群的初步歸類與劃分，為今后育種實(shí)踐中有目的地選擇親本、拓寬遺傳基礎(chǔ)培育玉米新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料是由黑龍江省菽錦科技有限責(zé)任公司提供的383份不同地區(qū)來源的玉米自交系。其中，黑龍江材料107份；內(nèi)蒙古材料111份；美國(guó)材料12份；意大利材料25份；中國(guó)南方收集材料87份，以及其他來源材料41份。材料名稱及來源見表1。

表1 383份玉米自交系名稱及來源Table 1 Names and origins of 383 maize inbred lines

在383份玉米材料中，部分材料屬于Lancaster群、Reid群、旅大紅骨群、唐四平頭群等玉米優(yōu)勢(shì)群，這些優(yōu)勢(shì)群是根據(jù)玉米種質(zhì)資源系譜和地理來源進(jìn)行劃分的[11]。將已經(jīng)確定優(yōu)勢(shì)群歸屬的玉米材料與其他遺傳背景不詳?shù)牟牧线M(jìn)行聚類分析，可以作為判斷材料優(yōu)勢(shì)群劃分的一個(gè)參考。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取玉米幼苗時(shí)期的葉片，利用CTAB的方法提取玉米總DNA[5]。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度。

1.2.2 SSR分析

SSR引物序列信息通過Maize GDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得，選用的引物由上海生物工程公司（Sangon）合成，試驗(yàn)所選用的引物名稱見表2。利用已篩選出多態(tài)性較好的26對(duì)SSR引物對(duì)玉米總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為每20 μL體積中含10×buffer（含 20 mmol·L-1Mg2+）2 μL，dNTP（25 mmol·L-1）0.2 μL，引物（20 μmol·L-1）0.26 μL，TaqDNA 聚合酶（2 U·μL-1）0.5 μL，DNA 模板 5.0 μL，ddH2O 12.04 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?94℃預(yù)變性5 min，然后以94℃變性1 min，退火2 min（退火溫度根據(jù)引物的具體Tm值進(jìn)行調(diào)整），70℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最后70℃延伸5 min，4℃保存。

表2 26對(duì)SSR引物名稱和檢測(cè)到的多態(tài)性指標(biāo)Table 2 Allelic numbers,PIC values and MI values for 26 SSR primers

1.2.3 電泳

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后通過6%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，恒定功率60 W，時(shí)間約90 min。采用快速銀染法進(jìn)行染色。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

SSR擴(kuò)增帶型以0、1、9進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，即在相同遷移率位置上，有條帶記為1，無條帶記為0，缺失數(shù)據(jù)記為9，建立分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)。

以簡(jiǎn)單相配系數(shù)（Simple matching coefficient）估計(jì)基因頻率，依據(jù)公式計(jì)算品種間的遺傳相似系數(shù)（Genetic similarity coefficient），計(jì)算公式為：GS=m/（m+n），m表示基因型間共有帶數(shù)目，n表示基因型間差異帶數(shù)目。為了比較品種間遺傳差異，利用Ntsyspc-2.10e軟件對(duì)383份材料進(jìn)行聚類分析，在遺傳相似系數(shù)矩陣的基礎(chǔ)上，用非加權(quán)平均法（Unweighted paired group method using arithmetic averages，UPGMA）構(gòu)建383份材料的樹狀聚類分析圖。

多態(tài)性信息量（Polymorphism information content,PIC）是指某個(gè)位點(diǎn)的預(yù)期異質(zhì)結(jié)合度，指從群體中隨機(jī)選取的兩個(gè)個(gè)體在某位點(diǎn)具有不同等位變異的可能性，多用來表示標(biāo)記檢測(cè)遺傳多樣性。根據(jù)Senior等提出的公式[12]：PIC=1-∑fi2，對(duì)每對(duì)SSR引物的多態(tài)性信息量進(jìn)行計(jì)算，其中fi表示某一位點(diǎn)的第i個(gè)等位變異在群體中出現(xiàn)的頻率。

每對(duì)SSR引物的標(biāo)記索引系數(shù)（Marker index,MI）根據(jù)Smith等提出的公式[10]：MI=等位基因數(shù)×PIC，進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

本研究利用篩選出的26對(duì)能夠擴(kuò)增出帶型穩(wěn)定、多態(tài)性好的玉米SSR引物，對(duì)383份玉米材料進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，383份玉米材料中，共檢測(cè)到117個(gè)等位基因變異，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為2～8個(gè)，平均4.5個(gè)。檢測(cè)等位基因數(shù)最多的引物為umc1590和mmc0132，等位基因數(shù)都為8個(gè)；最少的引物為phi227562，等位基因數(shù)為2個(gè)。26個(gè)SSR位點(diǎn)均表現(xiàn)出多態(tài)性，表明在分子標(biāo)記水平上，研究的383份玉米材料具有較豐富的遺傳變異。

26個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（PIC值）變異范圍在0.371～0.846之間，平均為0.647。標(biāo)記索引值（MI）的變化范圍介于0.743～6.769之間。綜合數(shù)據(jù)表明，等位基因數(shù)、PIC值以及MI值，這三個(gè)衡量引物多態(tài)性指標(biāo)的結(jié)果相一致，說明材料之間具有較高的遺傳多樣性。研究結(jié)果表明，SSR標(biāo)記技術(shù)具有較強(qiáng)的檢測(cè)玉米遺傳多態(tài)性的能力。

2.2 聚類分析

根據(jù)統(tǒng)計(jì)的SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)結(jié)果，通過軟件分析計(jì)算，得到383份玉米材料之間的遺傳相似系數(shù)。根據(jù)383份玉米材料之間的遺傳相似系數(shù)矩陣，利用UPGMA法進(jìn)行分析，得到聚類分析圖（見表3）。在遺傳相似系數(shù)為0.536的水平上，可以將383份玉米材料劃分為六類。其中367份玉米材料可被劃分在第Ⅰ類中；第Ⅱ類有2份材料，HN43和HN51；第Ⅲ類有1份材料：9722；第Ⅳ類有1份材料，南引84；第Ⅴ類有7份材料，HN53、HN83、HN71、HN59、HN72、04-246 和WM40；第Ⅵ類有5份材料，HN90、P67、P69、P70、P71。

表3 383份玉米材料的SSR聚類結(jié)果Table 3 Cluster analysis of 383 maize inbred lines

由于第Ⅰ類材料數(shù)量多，可以根據(jù)遺傳相似系數(shù)將第Ⅰ類進(jìn)行亞類的劃分。根據(jù)表3所顯示的相關(guān)信息，參照其中已知系譜來源及優(yōu)勢(shì)群歸屬的玉米材料，對(duì)第Ⅰ類中的其他玉米材料進(jìn)行具體的優(yōu)勢(shì)類群劃分。

①在遺傳相似系數(shù)為0.646的水平上（見圖1），6份意大利材料：my-1、my-3、my-5、my-6、my-7和my-8，與丹598聚為一類，在這6份意大利材料中，與丹598親緣關(guān)系較近的是my-6，與丹598親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的是my-7。

圖1 6份意大利材料的聚類分析Fig.1 Cluster analysis for six maize inbred lines from Italia

圖2 意大利與美國(guó)材料的聚類分析Fig.2 Cluster analysis for maize inbred lines from Italia and America

②由圖2可以看出，17份意大利E05系列材料，在遺傳相似系數(shù)為0.669水平上被劃分為一類，并且與材料東237，以及3份美國(guó)材料（M288-3、M289-1和M289-2）聚在同一類中，說明E05系列材料與部分美國(guó)材料親緣關(guān)系相近。

③在遺傳相似系數(shù)為0.666的水平上，12份美國(guó)材料中，有9份材料與已知屬于Reid類群的材料（如：沈5003、掖478、9046）聚為一類，由此可以確定此材料所在類群屬于Reid優(yōu)勢(shì)群。由圖3可知，編號(hào)為P27的材料是黃早四的改良系，以及屬于旅大紅骨類群的旅28也被劃分到Reid類群中。

圖3 12份美國(guó)材料的聚類分析Fig.3 Cluster analysis for 12 maize inbred lines from America

④ 在 JG16、JG11、P72、P75、P83、P87、P90、P91、P96、P97、P99、P100、P104、P105、P106、P109和P114這17份材料中，因P106、P114和P83都含有黃早四血緣，可將它們?cè)谶z傳相似系數(shù)為0.683處，聚為一類，材料間親緣關(guān)系相近，遺傳背景相似，可能含有黃早四血緣，黃早四是唐四平頭類群的代表，因此可將此類群稱為唐四平頭群。結(jié)果見圖4。

⑤ 編號(hào)為 P74、P76、P77、P79、P80、P82、P89、P92、P93、P95、P98、P103和P107的材料，可以在遺傳系數(shù)為0.695處，將它們聚為一類，這些材料多數(shù)屬于Mo17的改良系，Mo17是Lancaster類群的代表，因此可以將這一類材料所在的類群稱為L(zhǎng)ancaster群。結(jié)果見圖5。

圖4 17份玉米材料的聚類分析Fig.4 Cluster analysis for 17 maize inbred lines

圖5 13份玉米材料的聚類分析Fig.5 Cluster analysis for 13 maize inbred lines

除了367份玉米材料以外，只有16份材料未被劃分在第一類中，而是被劃分到另外的5類中。由圖6可知，這5大類的品種與第Ⅰ類的遺傳距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在第Ⅵ類中，P67為Y0261改良系，P69為鄭32與3042的改良系，根據(jù)兩個(gè)品種的相關(guān)信息，可以初步確定劃分到同一類組群中其他材料的遺傳背景與親緣關(guān)系。

由聚類分析圖可以看出，根據(jù)已知遺傳背景材料的分布，可以將玉米材料進(jìn)行初步的類群歸類，由于材料數(shù)量大，仍有一部分材料未被劃分到已知的玉米優(yōu)勢(shì)群體中。通過對(duì)玉米自交系材料的聚類分析，可對(duì)玉米種質(zhì)的整理和分類，選育自交系材料、選配組合和種質(zhì)改良等研究提供一定的參考依據(jù)。

圖6 16份玉米材料的聚類分析Fig.6 Cluster analysis for 16 maize inbred lines

3 討論

3.1 SSR標(biāo)記與玉米遺傳多樣性分析

目前，分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到玉米種質(zhì)遺傳多樣性研究上。對(duì)常用的幾種分子標(biāo)記應(yīng)用進(jìn)行比較。RFLP標(biāo)記需要DNA量多，技術(shù)復(fù)雜，費(fèi)用大；RAPD標(biāo)記雖然需要DNA量少，分析程序簡(jiǎn)單，但它屬于顯性標(biāo)記，且重復(fù)性差；AFLP標(biāo)記多態(tài)性好，但由于受到專利保護(hù)，進(jìn)入商業(yè)化應(yīng)用受到一定限制，且費(fèi)用較高，技術(shù)復(fù)雜，工作量大，限制了它的應(yīng)用[13]。SSR標(biāo)記因其具有數(shù)量豐富、共顯性遺傳、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好、DNA質(zhì)量要求不高以及費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，使得SSR標(biāo)記被認(rèn)為是最適合分析玉米種質(zhì)遺傳多樣性及劃分雜種優(yōu)勢(shì)群的分子標(biāo)記[14-15]。

本文利用26對(duì)SSR引物分析了383份玉米材料的遺傳多樣性，平均每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為4.5個(gè)，平均PIC值為0.647。這一結(jié)果低于Taramino等得到的平均位點(diǎn)等位基因數(shù)6.6和平均PIC值0.76[16]，低于張建華等得到的平均位點(diǎn)等位基因數(shù)11.4和平均PIC值0.709[17]，高于吳永升等得到的平均位點(diǎn)等位基因數(shù)3.92和平均PIC值0.59和聶永心等得到的平均位點(diǎn)等位基因數(shù)4.01和PIC值0.599[18-19]。造成這些差異的可能原因有收集到的玉米材料絕大部分來自于我國(guó)，由于我國(guó)玉米種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)較窄，因此需要引進(jìn)外國(guó)種質(zhì)進(jìn)行玉米種質(zhì)的改良。

3.2 玉米材料的優(yōu)勢(shì)類群的劃分

利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)材料進(jìn)行DNA水平上的檢測(cè)，可以不受環(huán)境影響，此方法比一般利用表現(xiàn)性狀的聚類方法更穩(wěn)定可靠[20]。本研究所收集的材料來源范圍廣、數(shù)量大、遺傳背景復(fù)雜。利用SSR標(biāo)記技術(shù)，通過軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得出聚類分析圖，可將383份玉米材料進(jìn)行類群劃分，大部分材料被劃分在第Ⅰ類中。

本研究選擇了多態(tài)性較高的26對(duì)玉米SSR引物，能夠準(zhǔn)確地反應(yīng)材料間的遺傳變異，但所選的SSR引物并沒有均勻分布在玉米各條染色體上，使聚類結(jié)果的應(yīng)用具有一定的局限性。在以后的研究中，可以篩選出多態(tài)性高的玉米引物，并且所用引物總體上能夠覆蓋玉米各染色體，通過增加SSR引物數(shù)對(duì)材料DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)充分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)，來提高聚類圖的精確度。

本研究通過與已知遺傳背景材料的比較與聚類分析，可將系譜來源不清的材料進(jìn)行已知優(yōu)勢(shì)群的劃分與歸類，能夠初步確定材料間的遺傳關(guān)系。此種方法可以避免育種的盲目性，并且能夠提高育種效率。因研究所用材料數(shù)量大，材料間遺傳關(guān)系復(fù)雜，有部分材料并沒有聚到我國(guó)常見的幾大類群之內(nèi)，此聚類結(jié)果與所選材料和所用的引物有很大關(guān)系，同時(shí)從另一方面說明所收集的玉米種質(zhì)資源相比之前的研究有了明顯的拓寬。

4 結(jié)論

利用26對(duì)SSR引物對(duì)383份玉米材料進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析。共檢測(cè)到117個(gè)等位基因變異，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為2～8個(gè)，平均4.5個(gè)，各SSR位點(diǎn)表現(xiàn)出的多態(tài)性，表明383份玉米材料具有較豐富的遺傳變異。三個(gè)引物多態(tài)性指標(biāo)：等位基因數(shù)、多態(tài)性信息量和標(biāo)記索引值在數(shù)值變化趨勢(shì)上相一致，說明SSR標(biāo)記技術(shù)具有較強(qiáng)的檢測(cè)玉米遺傳多態(tài)性的能力。根據(jù)軟件處理，可知材料間的遺傳相似系數(shù)在0.407～0.983之間，通過UPGMA方法進(jìn)行聚類作圖分析，供試材料在遺傳相似系數(shù)為0.536的水平上劃分為6類。研究通過聚類將一些未確定遺傳背景的材料與已知的材料劃分為同一類群中，初步判斷了材料的遺傳背景。研究結(jié)果可以為今后育種實(shí)踐有目的地選擇親本，培育玉米新品種提供技術(shù)支撐。

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