劉 韓，關 宏，楊文欽，王慧榮，張 琪，劉吉成

（齊齊哈爾醫(yī)學院微生態(tài)工程技術中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

雙歧桿菌（Bifidobacteria）是健康個體腸道中的優(yōu)勢菌，在人的一生中與人始終保持著共生關系。研究表明，雙歧桿菌具有調整腸道菌群[1-2]、防止便秘、降低結腸癌的發(fā)病率[3]、產生抗菌素[4]、增強免疫系統(tǒng)[5]、緩解乳糖不耐癥以及降低膽固醇等功效[6]。由于在人類生理方面發(fā)揮的重要作用，雙歧桿菌現(xiàn)已成為商業(yè)上優(yōu)選的益生菌。其中青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentic）是青年個體腸道中的優(yōu)勢菌，對人體產生許多益生作用。但由于青春雙歧桿菌對氧非常敏感，對低pH的抵抗能力差，并對營養(yǎng)要求苛刻，在獲取高活菌數(shù)培養(yǎng)物時有一定困難。Annan等研究指出凝膠微球包囊法能夠改善青春雙歧桿菌暴露在胃腸道時的存活率[7]；許多研究報道添加蛋白胨、半胱氨酸、酵母浸出物、寡聚糖等營養(yǎng)物質可以提高雙歧桿菌的活菌數(shù)[8-11]，但成本過高、操作繁瑣，不適合大規(guī)模生產使用。田寒友等曾對一株長雙歧桿菌進行了工業(yè)化培養(yǎng)基的篩選[12]。然而，青春雙歧桿菌工業(yè)化培養(yǎng)基方面的相關報道很少。本文篩選了幾種價格低廉的商業(yè)化產品作為青春雙歧桿菌生長所需碳源和氮源，篩選出了青春雙歧桿菌工業(yè)化培養(yǎng)基成分。利用此培養(yǎng)基優(yōu)化了對青春雙歧桿菌活菌數(shù)的影響的接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間一系列生長條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與試劑

青春雙歧桿菌23001，現(xiàn)保藏于齊齊哈爾醫(yī)學院微生態(tài)工程技術推廣中心。

完達山脫脂乳粉，ALPAVIT乳清粉，葡萄糖，雙歧因子A（購自于江門量子高科生物有限公司）；雙歧因子B（購自于大慶日月星有限公司）。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良MRS培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基中添加0.5%半胱氨酸），雙歧桿菌培養(yǎng)基0233，10%脫脂乳培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器與設備

SHEL LAB公司厭氧培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司高壓蒸汽滅菌器，梅特勒-托利多pH計，奧林巴斯電子顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化

在厭氧條件下，利用雙歧桿菌培養(yǎng)基0233對青春雙歧桿菌凍干粉進行復蘇，37℃厭氧培養(yǎng)48 h；按5%（V/V）的接種量接種到10%脫脂乳中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h。菌種放置在4℃冰箱保存，每次試驗前活化1次。

1.2.2 活菌數(shù)的測定

菌落總數(shù)按GB/T 4789.2-2003規(guī)定的平板菌落計數(shù)法進行測定。菌液以10倍梯度稀釋，用改良MRS培養(yǎng)基傾注到稀釋液平皿中，37℃厭氧培養(yǎng)72 h。

1.2.3 菌液pH值的測定

利用pH計測定。

1.2.4 青春雙歧桿菌工業(yè)化培養(yǎng)基成分的篩選

以雙歧因子A、葡萄糖、乳清粉、雙歧因子B、脫脂乳這幾種價格低廉的商業(yè)化產品作為培養(yǎng)基成分，每次選擇其中一個因素做單因素試驗，5%接種，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液活菌數(shù)及pH值。

1.2.4.1 雙歧因子A含量的確定

以 8%（W/V）脫脂乳、1%（W/V）雙歧因子 B、1%（W/V）乳清粉和1%（W/V）葡萄糖為基礎培養(yǎng)基，分別添加0、0.5%、1%和2%（W/V）的雙歧因子A，5%接種，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液活菌數(shù)、pH值。

1.2.4.2 葡萄糖含量的確定

以8%脫脂乳、1%雙歧因子A、1%乳清粉和1%雙歧因子B為基礎培養(yǎng)基，分別添加0、0.5%、1%和2%的葡萄糖，5%接種，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液活菌數(shù)及pH值。

1.2.4.3 乳清粉含量的確定

以8%脫脂乳、1%雙歧因子A和1%雙歧因子B為基礎培養(yǎng)基，分別添加0、0.5%、1%和2%的乳清粉，5%接種，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液活菌數(shù)及pH值。

1.2.4.4 雙歧因子B含量的確定

以8%脫脂乳、1%雙歧因子A為基礎培養(yǎng)基，分別添加0、0.5%、1%和2%的雙歧因子B，5%接種，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液活菌數(shù)及pH值。

1.2.4.5 脫脂乳含量的確定

以1%雙歧因子A、1%雙歧因子B為基礎培養(yǎng)基，分別添加4%、6%、8%和10%的脫脂乳，5%接種，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液活菌數(shù)及pH值。

1.2.5 生長條件的優(yōu)化

1.2.5.1 最佳接種量的確定

在篩選出的工業(yè)化培養(yǎng)基中分別接種1%、3%、5%和7%（V/V）的菌種（菌種活菌數(shù)為6.5×108cfu·mL-1），37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液活菌數(shù)及pH值。

1.2.5.2 最佳培養(yǎng)溫度的確定

在篩選出的工業(yè)化培養(yǎng)基中接種1%的菌種，分別在37、39和42℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液活菌數(shù)及pH值。

1.2.5.3 生長曲線的測定及pH變化

1%接種量接種于篩選出的工業(yè)化培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)，分別于第0、3、6、9、12、15、21和24 h取樣測定發(fā)酵液活菌數(shù)，以培養(yǎng)時間為橫坐標，相應菌數(shù)的對數(shù)值為縱坐標，繪制生長曲線，同時測定培養(yǎng)基pH值。

2 結果與分析

2.1 雙歧因子A含量對青春雙歧桿菌影響

由圖1可知，未添加雙歧因子A的培養(yǎng)基中青春雙歧桿菌活菌數(shù)小于107cfu·mL-1，pH 5.227。而添加不同濃度雙歧因子A的培養(yǎng)基中青春雙歧桿菌活菌數(shù)都大于108cfu·mL-1，pH差異不大（4.090～4.167）?？梢婋p歧因子A的存在對青春雙歧桿菌的生長有明顯的促進作用。此外，當雙歧因子A添加量為1%時，青春雙歧桿菌活菌數(shù)最高為6.55×108cfu·mL-1。因此，選擇雙歧因子A添加量為1%。

圖1 雙歧因子A含量對青春雙歧桿菌影響Fig.1 Effect of Bifidobacterium factor A on the growth of B.adolescentic

2.2 葡萄糖含量對青春雙歧桿菌影響

由圖2可知，添加不同含量的葡萄糖對青春雙歧桿菌活菌數(shù)及pH沒有明顯的影響，這與文獻報道添加葡萄糖對雙歧桿菌生長有促進作用的結論不一致[13]，原因可能是由于當培養(yǎng)基中添加一定濃度雙歧因子A后掩蓋了葡萄糖對青春雙歧桿菌生長的促進作用。從降低生產成本和提高青春雙歧桿菌活菌數(shù)兩方面綜合考慮，選擇葡萄糖添加量為0。

2.3 乳清粉含量對青春雙歧桿菌影響

由圖3可知，在含有8%脫脂乳、1%雙歧因子A和1%雙歧因子B的培養(yǎng)基中添加不同濃度的乳清粉對青春雙歧桿菌生長沒有明顯的影響。從降低生產成本和提高青春雙歧桿菌活菌數(shù)兩方面綜合考慮，選擇乳清粉添加量為0。

圖2 葡萄糖含量對青春雙歧桿菌影響Fig.2 Effect of contents of glucose on B.adolescentic

圖3 乳清粉含量對青春雙歧桿菌影響Fig.3 Effect of contents of whey powder on B.adolescentic

2.4 雙歧因子B對青春雙歧桿菌影響

由圖4可知，在添加不同濃度的雙歧因子B的培養(yǎng)基中，青春雙歧桿菌活菌數(shù)均大于108cfu·mL-1，pH無明顯差異。此外，當雙歧因子B添加量為1%時，青春雙歧桿菌活菌數(shù)相對較高為4.4×108cfu·mL-1。因此，選擇雙歧因子B添加量為1%。

圖4 雙歧因子B含量對青春雙歧桿菌影響Fig.4 Effect of Bifidobacterium factor B on B.adolescentic

2.5 脫脂乳含量對青春雙歧桿菌影響

由圖5可知，培養(yǎng)基中脫脂乳含量為4%時，青春雙歧桿菌活菌數(shù)為6.6×107cfu·mL-1，而脫脂乳含量為6%以上時，青春雙歧桿菌活菌數(shù)均為108cfu·mL-1以上；不同發(fā)酵液的pH差異不大。由此可以看出，培養(yǎng)基中含有1%雙歧因子A和1%雙歧因子B的同時，只有當脫脂乳含量在6%以上時才能保障青春雙歧桿菌生長充足的氮源和碳源。脫脂乳含量為6%和8%的發(fā)酵液中青春雙歧桿菌活菌數(shù)差異不大，由于脫脂乳含量為8%的發(fā)酵液狀態(tài)明顯優(yōu)于6%的發(fā)酵液，因此，青春雙歧桿菌工業(yè)化培養(yǎng)基選擇脫脂乳含量為8%。

圖5 脫脂乳含量對青春雙歧桿菌影響Fig.5 Effect of contents of skim milk on B.adolescentic

2.6 最佳接種量的確定

由圖6可知，接種量為1%、3%和5%（V/V）時，發(fā)酵液中青春雙歧桿菌活菌數(shù)及pH基本一致，當接種量為7%時，發(fā)酵液中青春雙歧桿菌活菌數(shù)有所下降。因此，選擇最佳接種量為1%（6.5×106cfu·mL-1）。

圖6 接種量對青春雙歧桿菌影響Fig.6 Effect of inoculation amount on B.adolescentic

2.7 最佳培養(yǎng)溫度的確定

由圖7可知，發(fā)酵液中青春雙歧桿菌活菌數(shù)隨培養(yǎng)溫度的升高而降低，青春雙歧桿菌在37℃生長最旺盛，與先前的研究結論一致[8]，因此，選擇37℃做為青春雙歧桿菌的最佳培養(yǎng)溫度。此外，由于青春雙歧桿菌在39和42℃培養(yǎng)時活菌數(shù)也在可以接受的范圍內（>108cfu·mL-1），因此，在特殊的生產工藝中也可將青春雙歧桿菌的培養(yǎng)溫度適度提高。

圖7 培養(yǎng)溫度對青春雙歧桿菌影響Fig.7 Effect of temperature on B.adolescenti

2.8 青春雙歧桿菌在工業(yè)化培養(yǎng)基中的生長特性

由圖8可知，青春雙歧桿菌在此培養(yǎng)基中的對數(shù)生長期為3～9 h，37℃厭氧培養(yǎng)9 h時，青春雙歧桿菌活菌數(shù)達到最高1.16×109cfu·mL-1。

3 討 論

雙歧桿菌對營養(yǎng)要求苛刻，培養(yǎng)基中除了含有細菌生長所必需的碳源和氮源外，還必須含有豐富的氨基酸、維生素和糖類等物質。Chou等研究了長雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌在添加酵母粉、蛋白胨等營養(yǎng)物質的豆乳中的生長特性[13]。杜鵬等研究了嬰兒雙歧桿菌在添加蛋白胨、酵母粉、胡蘿卜汁和低聚糖等營養(yǎng)物質的發(fā)酵培養(yǎng)基的生長特性[10]。孟祥晨等采用正交試驗優(yōu)化了青春雙歧桿菌基礎培養(yǎng)基及增殖因子的用量，得到了青春雙歧桿菌增菌培養(yǎng)基[8]。但上述培養(yǎng)基成分復雜、操作繁瑣、成本較高不適宜大規(guī)模生產，此外雙歧桿菌對氧氣十分敏感，在培養(yǎng)以及保存時受到一定的限制。

本研究確定的青春雙歧桿菌工業(yè)化培養(yǎng)基解決了青春雙歧桿菌培養(yǎng)困難、生產成本高和不適合規(guī)模化生產的問題。有關菌液濃縮及凍干條件還需進一步考察，將菌液制成高活菌數(shù)的凍干菌粉，解決保存困難的問題。

4 結論

通過單因素試驗確定青春雙歧桿菌工業(yè)化培養(yǎng)基成分為：脫脂乳8%（W/V）、雙歧因子A 1%（W/V）、雙歧因子B 1%（W/V）。利用上述培養(yǎng)基，確定了青春雙歧桿菌的最佳接種量為1%（V/V）、最佳培養(yǎng)溫度為37℃。在此條件下，測定了青春雙歧桿菌的生長曲線和pH值變化，在37℃厭氧條件下培養(yǎng)時間9 h為最佳生長條件，此時青春雙歧桿菌活菌數(shù)最高可達1.16×109cfu·mL-1。雙歧因子A的存在對青春雙歧桿菌的生長有明顯促進作用。

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