趙西耀,陳煜森,何芳梅,趙磊,劉梁芳,潘劍罡,趙斌

Htra2(High temperature requirement A2),也稱作Omi,是Htra絲氨酸蛋白酶家族的一個(gè)新成員,在大部分的正常組織器官中都有其表達(dá)。該基因位于人類染色體2p13.1。Htra2是一類較為特殊的蛋白質(zhì),它既具有誘導(dǎo)凋亡的蛋白酶活性,同時(shí)還是分子伴侶,具有細(xì)胞保護(hù)作用。Htra2既可以通過(guò)氨基末端的Reaper樣基序[Ala-Val-Pro-Ser(AVPS)]與凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)相互作用來(lái)誘導(dǎo)凋亡,亦可以通過(guò)caspase非依賴性,即直接利用其蛋白酶活性發(fā)揮促凋亡作用[1]。推測(cè)Htra2缺乏時(shí)將導(dǎo)致機(jī)體發(fā)育過(guò)程中某些應(yīng)該凋亡消失的細(xì)胞不能夠自然崩解而致病[2]。另一方面,Krick等通過(guò)H tra2基因靶向刪除等方法發(fā)現(xiàn),鼠對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)更敏感,推測(cè)Htra2在神經(jīng)元內(nèi)的主要角色可能是對(duì)抗應(yīng)激的神經(jīng)保護(hù)作用,并認(rèn)為Htra2發(fā)揮抗凋亡或促凋亡活性,取決于所在的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和相互作用蛋白,在線粒體中以抵抗氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用為主;在胞漿中,以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用為主[3]。

自1977年發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子以來(lái),內(nèi)含子功能的研究一直受到人們的關(guān)注。在許多基因的內(nèi)含子中均發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)的調(diào)控元件,其中大多為增強(qiáng)元件,可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄的起始來(lái)增強(qiáng)基因的表達(dá);此外,一些內(nèi)含子在基因的表達(dá)中起抑制作用;一些基因的內(nèi)含子突變會(huì)引起基因表達(dá)效應(yīng)的變化。單核苷酸多態(tài)性是一種重要的遺傳標(biāo)記。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Htra2基因多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與帕金森病相關(guān)[4-5]。Htra2基因內(nèi)含子5-59A/G(rs2241027)位點(diǎn)的多態(tài)性(等位基因?yàn)锳和G)與帕金森病關(guān)系的研究在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)導(dǎo)。我們?cè)诨浳鞯貐^(qū)漢族人群中檢測(cè)Htra2基因內(nèi)含子5-59A/G位點(diǎn)頻率的分布特點(diǎn),并分析其基因多態(tài)性與帕金森病的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2004年3月～2008年9月本院神經(jīng)內(nèi)科住院的帕金森病患者56例作為病例組,其中男性35例,女性21例;年齡50～89歲,平均(67.91±9.80)歲。均為粵西地區(qū)的漢族人。所有病例均按照2006年中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)帕金森病及運(yùn)動(dòng)障礙學(xué)組討論決定的帕金森病診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選擇,并排除非帕金森病的診斷。本院健康體檢者109例作為對(duì)照組,其中男性68例,女性 41例;年齡52～86歲,平均(68.62±8.31)歲。均為漢族人,無(wú)帕金森病病史。兩組間男女比例(P=0.627)、平均年齡(P=0.627)均無(wú)顯著性差異。

所有標(biāo)本的收集均經(jīng)其本人或家屬同意,并經(jīng)廣東醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)同意。

1.2 DNA的提取和Htra2基因的分型 取早晨空腹靜脈血5 ml,3.8%檸檬酸鈉抗凝,碘化鉀法提取外周血白細(xì)胞的DNA。用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)法檢測(cè)病例組和對(duì)照組全部樣本Htra2基因內(nèi)含子5-59A/G位點(diǎn)的多態(tài)性。根據(jù)5-59A/G位點(diǎn)及其兩側(cè)的DNA序列用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物,用 NEBcutter V2.0設(shè)計(jì)Bsp1268I限制性內(nèi)切酶,根據(jù)酶切片段條帶的不同分析其基因型和多態(tài)性。

引物由上海生工合成,上游引物:5′-TGT GGG AAG GGT AGG TT-3′,下游 引物 :5′-GGA TGG CAA AGG AGA TT-3′。PCR反應(yīng)體系 13.02 μL,其中包括 10×Buffer 1.15 μL,dNTP(10 mmol/L)1.0 μL,引物(20 μ mol/L)0.25 μL,基因組 DNA 1.0 μL,Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.12 μL,H2O 9.25 μL。PCR 反應(yīng)條件:94℃,熱變性5 min,94℃45 s,退火54.6℃44s,延伸72℃42 s,擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)后延伸72℃10 min,終止反應(yīng) 。取 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 2 μL、NEB Buffer 0.5 μL、Bsp1268I 0.25 μL、三蒸水 2.25 μL,使總體系為5 μL,30℃酶切7 h,進(jìn)行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。100 V電泳4 h后用銀染法染色,觀察結(jié)果。含有Htra2基因5-59A/G的PCR產(chǎn)物是241 bp,經(jīng)Bsp1268I酶消化后產(chǎn)生兩個(gè)片段分別是 123 bp和118 bp兩端大小片斷。雜合子AG基因型則有3個(gè)片段,分別為241 bp、123 bp和 118 bp;純合子AA 基因型則只有1個(gè)片斷,大小241 bp;純合子GG基因型有2個(gè)片斷:123 bp和118 bp。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件和遺傳學(xué)數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法對(duì)所有資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?；蛐秃偷任换蝾l率采用直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)。研究對(duì)象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度、基因型和等位基因頻率的組間比較采用四格表χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)分析,顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

Htra2基因內(nèi)含子5-59A/G位點(diǎn)上從A到G的突變產(chǎn)生了Bsp1268I限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。酶切該多態(tài)性位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物后電泳圖如下。

圖1 5-59A/G位點(diǎn)擴(kuò)增片段 Bsp1286I酶切產(chǎn)物電泳圖

病例組(χ2=0.091,P=0.956)與對(duì)照組(χ2=0.920,P=0.337)人群中Htra2基因內(nèi)含子5-59A/G位點(diǎn)的基因型分布經(jīng)Pearson χ2檢驗(yàn)均符合Hardy-Weinberg平衡,表明Htra2基因內(nèi)含子5-59A/G位點(diǎn)的基因型分布在所研究的人群中已達(dá)到了遺傳平衡。病例組和對(duì)照組 3種基因型頻率分別是:AA:21.4%(12/56),AG:50.0%(28/56),GG:28.6%(16/56)和AA:11.0%(12/109),AG:51.4%(55/109),GG:37.6%(42/109)。AA基因型及等位基因A與帕金森病均有相關(guān)傾向。見表1。

表1 兩組Htra2基因內(nèi)含子5-59A/G位點(diǎn)多態(tài)性[n(%)]

經(jīng)性別分層后,男性病例組A等位基因頻率略高于對(duì)照組(P=0.051),OR=1.788,95%CI:0.994～3.217。病例組AA基因型頻率高于對(duì)照組(P=0.041),OR=0.332,95%CI:0.112～0.985。在女性中,病例組的A等位基因頻率與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P=0.681),OR=1.172,95%CI:0.551～2.494。GG基因型也無(wú)顯著性差異(P=0.657),OR=1.296,95%CI:0.412～4.077。見表2。

表2 兩組不同性別5-59A/G位點(diǎn)多態(tài)性[n(%)]

3 討論

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是常見于中老年人的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失和路易小體形成為特征。帕金森病病因迄今不明,目前普遍認(rèn)為多種因素可能參與帕金森病的發(fā)病,遺傳因素可使患病易感性增加。Htra2作為一種核編碼線粒蛋白酶,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成,在線粒體膜間隙儲(chǔ)存。當(dāng)細(xì)胞受到刺激發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí),線粒體膜通透性增加,Htra2分子從線粒體釋放并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核中。在胞質(zhì)中,它通過(guò)N端4殘基IAP結(jié)合要區(qū)結(jié)合IAP的桿狀病毒IAP重復(fù)結(jié)構(gòu)域,通過(guò)破壞caspase-IAP復(fù)合物,和/或誘導(dǎo)IAPs的自動(dòng)泛素化和降解,促進(jìn)了caspase-3、7、9活性,因而解除了IAPs對(duì)caspases的阻止,誘發(fā)凋亡。同時(shí)還可借自身的酶活性切割、降解 IAPs[6]。另外,Htra2還具有caspase非依賴的致凋亡作用[1],其作用機(jī)制還有待研究。另外,通過(guò)Htra2基因靶向刪除、轉(zhuǎn)基因表達(dá)、免疫印跡、測(cè)定細(xì)胞膜電位等方法,發(fā)現(xiàn)鼠Htra2基因靶向刪除對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)更敏感,與對(duì)照組比較更易誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。神經(jīng)元特異性Htra2過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因鼠并沒有出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡增加,也并未出現(xiàn)表型異常,推測(cè)Htra2在神經(jīng)元內(nèi)的主要角色可能是對(duì)抗應(yīng)激的神經(jīng)保護(hù)作用[3]。近來(lái)還發(fā)現(xiàn)其對(duì)Parkin相關(guān)的泛素蛋白酶體有重要的影響[7],及參與氧化磷酸化過(guò)程[8]。

近年來(lái),其基因突變與帕金森的相關(guān)性研究成亦受到了人們的重視。Strauss等對(duì)414例帕金森患者和331例健康人的G421T多態(tài)性相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn),病例組中有26例雜合子個(gè)體(6.2%),對(duì)照組中只有10例(3%),并驗(yàn)證了A141S基因多態(tài)性與帕金森病呈顯著性相關(guān)(P＜0.05),同時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)突變的純合子攜帶者;相比之下,在4個(gè)散發(fā)性的帕金森病患者中得到確認(rèn)的G1195A的替代,在健康對(duì)照的740條同源染色體中卻沒有發(fā)現(xiàn)。他們還在原發(fā)性帕金森病患者大腦Lewy小體中檢測(cè)到了Htra2分子;同時(shí)觀察到編碼Htra2的基因發(fā)生突變時(shí),引起了與帕金森病特征相同的神經(jīng)變性[4]。Bogaerts等通過(guò)突變分析等方法驗(yàn)證了 Htra2的 PDZ區(qū)域的一個(gè)新的突變位點(diǎn)Arg404Trp,該位點(diǎn)的突變預(yù)測(cè)將失活Htra2。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因分析的數(shù)據(jù),測(cè)序等方法,在可能影響Htra2表達(dá)的5′和 3′區(qū)域,驗(yàn)證了 6個(gè)患者特異性突變體,并推測(cè)此突變可能影響了其轉(zhuǎn)錄活性[5]。但也有無(wú)相關(guān)性的報(bào)道[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致可能是由于種族、地區(qū)、試驗(yàn)方法、結(jié)果的判定等因素的差異引起。

近年來(lái),人們對(duì)內(nèi)含子的功能提出許多新的見解[10]:①內(nèi)含子通過(guò)啟動(dòng)子、起始位點(diǎn)的堿基配對(duì),可以阻止或增強(qiáng)RNA聚合酶的作用;②內(nèi)含子具有各種剪接信號(hào),不同的細(xì)胞可以選擇不同的拼接點(diǎn),對(duì)外顯子進(jìn)行有選擇地拼接,形成不同的成熟mRNA;③內(nèi)含子也許有自已特定的蛋白質(zhì)編碼。內(nèi)含子可以對(duì)基因表達(dá)起增強(qiáng)或抑制作用。

本研究所選Htra2基因5-59A/G位點(diǎn)處從G到A的突變導(dǎo)致了Bsp1268I酶的限制性酶切位點(diǎn)。我們檢測(cè)了粵西地區(qū)56例帕金森患者和109例健康人的H tra2基因內(nèi)含子5-59A/G位點(diǎn)的基因型,分析其基因型和等位基因頻率分布以及它們與帕金森病之間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示,H tra2基因內(nèi)含子5-59A/G位點(diǎn)的AA基因型及等位基因A與帕金森病均有相關(guān)傾向;在經(jīng)過(guò)性別分層后,男性AA基因型與帕金森病具有相關(guān)性,而Htra2基因5-59A/G多態(tài)性與女性帕金森病發(fā)病無(wú)關(guān)。結(jié)合內(nèi)含子的功能特點(diǎn),推測(cè)該位點(diǎn)與帕金森病的相關(guān)性可能是通過(guò)影響基因分子構(gòu)象轉(zhuǎn)錄時(shí)剪切位置,和/或影響與相應(yīng)蛋白結(jié)合,進(jìn)而影響基因轉(zhuǎn)錄的起始和延伸等過(guò)程,影響了Htra2的蛋白酶活性,最終促進(jìn)了帕金森病的發(fā)生。相關(guān)性局限于男性,可能因性激素等引起。尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究的樣本較小,其代表性與普通人群可能有差異,因此有必要對(duì) Htra2基因位點(diǎn)內(nèi)含子4之5-59A/G位點(diǎn)進(jìn)一步深入研究,以正確評(píng)價(jià)其多態(tài)性在帕金森病中的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用價(jià)值。

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