湯海鷗 高秀華 黃 輝

復合酶制劑以綜合各種單酶于一體為優(yōu)勢已經(jīng)在飼料中得到廣泛應用，而且在畜牧業(yè)生產(chǎn)中起到了重要的作用，并起到了非常明顯的效果。復合酶多以單株菌種發(fā)酵再以互補復配的方式進行生產(chǎn)，因其含有單酶品種多，在進行酶制劑檢測的過程中各單酶之間可能存在的干擾一直妨礙著復合酶制劑活性的準確測定，例如酸性蛋白酶是否會影響其他酶制劑活性的表達等[1]。鑒于此，本試驗以各種單酶為研究對象用不同方式進行混合，再進行測定酶活，以研究復合酶檢測過程中存在的問題和正確的測定方法，為商品復合酶制劑產(chǎn)品的酶活測定和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶和酸性蛋白酶樣品由北京挑戰(zhàn)生物技術有限公司提供，試驗中以測定的酶活實際值為準。

1.2 木聚糖酶活力測定方法

1.2.1 酶活定義

樣品在溫度37℃、pH值5.5的條件下，1 min內(nèi)從燕麥木聚糖（濃度為1%）中產(chǎn)生了1 μmol木糖所需的酶量，為一個木聚糖酶活性單位（U）。

1.2.2 底物（1%燕麥木聚糖）配置

稱取1.00 g燕麥木聚糖，用80 ml左右的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液溶解，于70℃下磁力攪拌半小時，冷涼后用醋酸調(diào)至pH值5.5，轉(zhuǎn)入容量瓶中，用緩沖液定容至100 ml。離心機4 000 r/min離心10 min后取上清液備用。4℃避光保存，有效期為3 d。

1.2.3 DNS試劑配置

稱取3,5-二硝基水楊酸3.15 g，加水500 ml，水浴至45℃，逐步加入100 ml 0.05 mol/l氫氧化鈉溶液，不斷攪拌，直到溶液清澈透明，再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0 g、苯酚2.50 g和無水亞硫酸鈉2.50 g，補加水300 ml，攪拌，溶解后停止加熱冷卻至室溫，用水定容至1 000 ml。儲存在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7 d后可以使用，有效期為6個月。

1.2.4 酶樣測定步驟

在試管中加入1.8 ml 1.0%的木聚糖底物，加入酶液 200 μl，37 ℃準確反應 10 min，加入 3.0 ml DNS 試劑，沸水浴5 min，空白制作時DNS先于酶液之前加入。540 nm波長處測定OD值。從木糖標準曲線求得木糖含量，計算酶活力單位。

1.2.5 木糖標準曲線制作

取15 ml刻度管7支，加入磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，再分別加 10 μmol/ml木糖標準液1.0 ml，以緩沖液為空白，反應測定步驟同1.2.4節(jié)。

1.3 纖維素酶、淀粉酶和酸性蛋白酶活力測定方法

纖維素酶酶活測定參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 912—2004[2]，淀粉酶和酸性蛋白酶酶活測定參照中華人民共和國輕工行業(yè)標準QB/T 1803—1993[3]。

1.4 試驗設計

1.4.1 各單酶活性的測定

分別測定木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶和酸性蛋白酶的活性，并測定各單酶中含有的其他3種酶活量（測定過程中，每個樣平行取3份，結(jié)果取平均值，下同）。

1.4.2 酸性蛋白酶對其他酶活性的影響試驗

試驗采取完全隨機的3×1×3設計方式：按照梯度1、0.5、0.1 g稱取木聚糖酶樣品（所有樣品稱量值保留四位有效數(shù)字），分別與0.2 g的酸性蛋白酶混合，酶提40 min，測定酶活，纖維素酶和淀粉酶同樣按照木聚糖酶試驗設計方式進行試驗，以上設計同比設定兩個處理溫度（20、37℃）。

1.4.3 四種單酶整體混合試驗

稱取木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶和酸性蛋白酶各10 g，將4種酶制劑混合在一起，用各酶相對應的緩沖液酶提40 min，然后測定各種酶的活性，并與原酶活測定值進行對比分析。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 各單酶活性的測定

供試木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶和酸性蛋白酶樣品的酶活測定結(jié)果，及各單酶中其他3種酶活含量如表1。

表1 供試樣品酶活測定結(jié)果（U/g）

由表1可以看出：4個樣品中除了木聚糖酶樣品外，其他3個酶制劑都含有一定量的木聚糖酶活性，其中尤其是纖維素酶樣品中含有較多量的木聚糖酶；非纖維素酶樣品中也都含有一定量的纖維素酶活性，其中以酸性蛋白酶樣品中纖維素酶活性含量較高；除淀粉酶和酸性蛋白酶樣品本身外，其他酶制劑中未檢測出淀粉酶和酸性蛋白酶活性，這主要原因可能與酶制劑的誘導物和分泌方式有關，相對于木聚糖酶和纖維素酶，淀粉酶和酸性蛋白酶對誘導物的要求更嚴格，且分泌方式多以胞內(nèi)為主[4]。

2.2 酸性蛋白酶對其他酶活性的影響

試驗設計按1.4.2節(jié)進行混合后，各酶制劑不同混合比例不同溫度下測定酶活值如表2。

將表2的酶活測定值與原酶活測定值進行比較，二者之間的相對誤差值如表3。

從表2和表3結(jié)果可以看出，所有酶活測定結(jié)果和原酶活值之間的相對誤差都在酶制劑檢測允許誤差8%之內(nèi)，且所有相對誤差都未超過3%，這說明酸性蛋白酶并沒有對其他酶制劑產(chǎn)品酶活產(chǎn)生很大的影響。同樣從不同溫度對比結(jié)果可以看出，酶提溫度的改變對酶活也沒有產(chǎn)生顯著影響。

2.3 四種單酶整體混合試驗結(jié)果

表2 酸性蛋白酶和不同酶制劑不同混合比例下各酶酶活測定值(U/g)

表3 表2測定酶活值與原酶活值之間的相對誤差計算結(jié)果(%)

試驗設計按照1.4.3節(jié)進行混合后，對樣品進行各種單酶活性的測定，將測定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)（即混合產(chǎn)生的質(zhì)量倍數(shù)4），并與混合前四種樣品中含酶總量進行對比，計算混合前后的相對誤差值見表4。

表4 四種單酶混合后酶活測定值及與混合前酶活總量之間的相對誤差結(jié)果

從表4結(jié)果可以看出，除木聚糖酶外，其他3種酶制劑的相對誤差都不到3%，在酶制劑檢測允許誤差范圍8%之內(nèi)，這說明各種酶制劑相互混合對纖維素酶、淀粉酶和酸性蛋白酶檢測沒有影響；木聚糖酶混合后的測定值和總酶活相對誤差值比較大，分析其原因可能是淀粉酶在酶提的過程中和載體淀粉發(fā)生反應產(chǎn)生還原糖造成的，木聚糖酶酶活的檢測原理是利用指示劑顯色酶解過程產(chǎn)生的還原糖的量來判定酶活。

鑒于以上分析，試驗進行了進一步論證，將木聚糖酶、纖維素酶和酸性蛋白酶按照1.4.3節(jié)混合方式進行對比檢測。并將測定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)（即混合產(chǎn)生的質(zhì)量倍數(shù)3），與混合前3種樣品中含酶總量進行對比，計算混合前后間的相對誤差值見表5。

表5 3種單酶混合后酶活測定值及與混合前酶活總量之間的相對誤差結(jié)果

從表5結(jié)果可以看出，除去淀粉酶后3種酶制劑檢測酶活值都在3%之內(nèi)，木聚糖酶混合后的測定值和總酶活相對誤差值為2.9%，遠小于酶制劑檢測允許誤差范圍8%，這說明排除淀粉酶產(chǎn)生還原糖的干擾后酶活檢測可以達到非常準確的判定。

3 討論

因為復合酶中含有酶種多，各單酶間的相互干擾因素比較復雜，尤其是一些以還原糖顯色為判定標準的酶活檢測方法易受復合酶中產(chǎn)生還原糖的干擾，所以復合酶的準確測定一直是復合酶質(zhì)量判定的一大難題。本試驗主要目的就是利用各種已知酶活樣品進行混合后再測定混合樣中各單酶酶活變化情況，以便研究復合酶中各單酶活性的檢測方法。

在實際復合酶制劑檢測過程中各單酶活性測定受影響因素主要有兩種：一是酶制劑本身對其他酶制劑酶活產(chǎn)生的影響，如酸性蛋白酶；二是酶制劑和載體在酶提的過程中發(fā)生酶解反應產(chǎn)生的產(chǎn)物對其他酶制劑活性檢測產(chǎn)生的影響，如淀粉酶。從本試驗結(jié)果可以看出，對于試驗選用的4種酶制劑檢測酶活值易受干擾的主要是木聚糖酶，其他3種酶制劑酶活測定值受酶制劑混合產(chǎn)生的影響很小；而木聚糖酶在排除淀粉酶的干擾后酶活檢測值基本不受影響。本試驗在選材的過程中根據(jù)酶制劑發(fā)酵產(chǎn)生方式和復合酶實際含單酶情況，選取兩類具有代表性的4種酶制劑，其他酶制劑可以根據(jù)酶學性質(zhì)做類似的推斷，也可以進行進一步的試驗進行準確論證。

[1]聶國興,李春喜,明紅,等.不同浸提方案對飼用木聚糖酶活性測定結(jié)果的影響[J].飼料工業(yè),2003,24(9):35-37.

[2]農(nóng)業(yè)部全國飼料工作辦公室,中國飼料工業(yè)協(xié)會,全國飼料工業(yè)標準化技術委員會等.NY/T 912—2004.飼料添加劑纖維素酶活力的測定分光光度法[A].飼料工業(yè)標準匯編(2002～2006)[C].北京:中國標準出版社,2006.

[3]全國食品發(fā)酵標準化中心,中國標準出版社第一編輯室.QB/T 1803—1993.工業(yè)酶制劑通用試驗方法[A].白酒標準匯編(第二版)[C].北京:中國標準出版社,2007.

[4]Astrid R.Stricker·Robert L.Mach·Leo H.de Graaff.Regulation of transcription of cellulases-and hemicellulases-encoding genes in Aspergillus niger and Hypocrea jecorina(Trichoderma reesei)[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.,2008,78:211-220.