彭立強(qiáng) 謝 云 任濤濤 陳五嶺

飼料添加劑是添加在飼料中的一種可食性物質(zhì)，以提高動(dòng)物的營養(yǎng)水平及補(bǔ)充足夠的營養(yǎng)。最初，飼料添加劑使用最普遍的主要是抗生素。但抗生素進(jìn)入動(dòng)物腸道后，除了殺死致病菌，還會破壞腸道正常菌群，致使動(dòng)物免疫力下降，而且抗生素還存在殘留和抗藥性等問題。為此，抗生素在飼料中的使用受到了嚴(yán)格的限制。微生態(tài)制劑是一種新型飼料添加劑，又叫微生物飼料添加劑，它能很好地克服抗生素的不足。微生物飼料添加劑是以微生態(tài)調(diào)控理論為指導(dǎo)，利用動(dòng)物體內(nèi)正常微生物及其代謝產(chǎn)物或生長促進(jìn)物，經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵、干燥、加工等特殊加工工藝制成的可直接飼喂動(dòng)物的活菌制劑。微生物飼料添加劑具有增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能、防治疾病、提高生產(chǎn)性能的作用，既能確保食品安全，改善畜禽產(chǎn)品品質(zhì)，又能減少畜禽排泄物的臭氣，改善養(yǎng)殖場生態(tài)環(huán)境。

作為微生物飼料添加劑的核心組成成分，微生物菌種的優(yōu)劣是決定后期發(fā)酵生產(chǎn)和產(chǎn)品最終應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素。在菌種篩選過程中，應(yīng)著重考察其耐酸、耐膽鹽的能力，以及對胃腸道環(huán)境的抵抗能力。而此過程中活菌計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，決定著我們對試驗(yàn)菌耐受能力的判斷，關(guān)系到該微生物飼料添加劑的應(yīng)用價(jià)值。通常，活菌計(jì)數(shù)的方法主要是平板稀釋法、比濁法、菌體干重法等，但這些方法都不夠理想，存在諸如工作量大、耗時(shí)長、誤差大、不能區(qū)分死活細(xì)胞等缺點(diǎn)。本試驗(yàn)采用MTT比色法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。該方法是利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶將外源性的MTT還原為難溶性的紫藍(lán)色結(jié)晶物甲瓚(Formazan)，用二甲基亞礬將其溶解釋放，再用酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD值，OD值的高低可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。MTT法簡單快速、重復(fù)性好、能夠較準(zhǔn)確地區(qū)分死活菌體細(xì)胞。

目前公認(rèn)能作為微生態(tài)制劑的菌種包括：乳酸菌類、芽孢桿菌類、酵母類、霉菌類及光合細(xì)菌等。本文的目的是根據(jù)微生態(tài)理論，選用嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌、釀酒酵母作為試驗(yàn)菌株，研制能應(yīng)用于養(yǎng)豬生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)高效的復(fù)合微生物飼料添加劑。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)菌：嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)，均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium），為本實(shí)驗(yàn)室自天津?qū)毜暇┴S養(yǎng)殖場發(fā)病豬體內(nèi)分離鑒定的菌株。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

1.2.1 培養(yǎng)基

①嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基；②納豆芽孢桿菌培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基；③釀酒酵母培養(yǎng)基：豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基；④指示菌培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.2.2 主要試劑和儀器

豬膽鹽（上海源聚生物科技有限公司生產(chǎn)）；胃蛋白酶、胰蛋白酶(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供)；MTT（噻唑藍(lán)）(北京伯樂泰克生物有限公司生產(chǎn))；DMSO(二甲基亞礬)(上海菲達(dá)工貿(mào)有限公司和橋分公司生產(chǎn))；超凈工作臺(SXK-103)；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海-恒科技有限公司生產(chǎn)）；多孔板分光光度計(jì)(酶標(biāo)儀，BIO-RAD-550，美國生產(chǎn))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的篩選活化及菌懸液的制備

①取出冷凍保藏的8株嗜酸乳桿菌經(jīng)MRS固體培養(yǎng)基連續(xù)活化3～4次后，分別測量pH值和活菌數(shù)，初篩出產(chǎn)酸和生長較快的菌株，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水稀釋成菌數(shù)為107CFU/ml的菌懸液作為試驗(yàn)菌液A。

②納豆芽孢桿菌接種于LB固體培養(yǎng)基中，活化3～4次，鏡檢后挑選生長旺盛、芽孢產(chǎn)生正常的菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)后用無菌生理鹽水稀釋為菌數(shù)107CFU/ml的實(shí)驗(yàn)菌液B。

③釀酒酵母先在豆芽汁蔗糖固體培養(yǎng)基活化3～4次，再接種到以淀粉為唯一碳源的平板上，根據(jù)透明圈大小，從中挑選淀粉酶活性最強(qiáng)的菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)后制成的實(shí)驗(yàn)菌液C，菌數(shù)為107CFU/ml。

④大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，活化3～4次后，制成菌數(shù)為107CFU/ml的指示菌液D、指示菌液E。

1.3.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法，以大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌作指示菌，對試驗(yàn)菌株嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌的抑菌效果進(jìn)行檢測（釀酒酵母對腸道病原菌的抑制效果不明顯，在抑菌實(shí)驗(yàn)部分不予討論）。自指示菌液D、指示菌液E中分別取0.4 ml加入培養(yǎng)基中，加入15 ml放冷至50℃的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，作為菌層，置于37℃干燥冷卻30 min，待其充分凝固。在無菌條件下，將3個(gè)無菌不銹鋼牛津杯等距放置于培養(yǎng)基表面，分別吸取0.25 ml實(shí)驗(yàn)菌液A、實(shí)驗(yàn)菌液B和AB混合液（每個(gè)試驗(yàn)菌3個(gè)重復(fù)）37℃恒溫培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測量抑菌圈的直徑，計(jì)算其平均值。

1.3.3 耐酸實(shí)驗(yàn)

將上述實(shí)驗(yàn)篩選出的菌株活化后，分別以2%的接種量，依次接種于pH值為2.0、3.0、4.0、5.0的3種實(shí)驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基（MRS液體培養(yǎng)基、豆芽汁蔗糖液體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基）中，37℃培養(yǎng)16 h，用MTT比色法測其活菌濃度。

1.3.4 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

初篩：將上述實(shí)驗(yàn)篩選出的3種菌株按點(diǎn)種法分別接入到對應(yīng)的3種固體培養(yǎng)基（加豬膽鹽0.3%）中，37℃恒溫培養(yǎng)3～4 d后觀察(重復(fù)3次)。挑選生長良好的菌株進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

復(fù)篩：在3種液體培養(yǎng)基中分別依次加入0.1、0.2、0.3、0.4 的豬膽鹽(w/v，%)，121 ℃滅菌 15 min。將初篩獲得的3種菌株接入上述已處理好的液體培養(yǎng)基中，同時(shí)接種不含豬膽鹽的培養(yǎng)基中作為對照。37℃，140 r/min搖床培養(yǎng)18 h，用MTT比色法測其活菌濃度。

1.3.5 人工模擬豬體胃腸道耐受性實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 人工胃液的耐受性實(shí)驗(yàn)

人工胃液的配制：NaCl 0.2%、胃蛋白酶0.35%，用1 N HCl調(diào)整pH值為3.0后，用細(xì)菌過濾器過濾后備用。

將試驗(yàn)菌液A、B、C以10%的接種量接入到人工胃液中，37℃、140 r/min搖床培養(yǎng)，以0 min時(shí)為對照，分別于 60、90、120 min取樣，MTT法測其活菌數(shù)，并計(jì)算存活率，重復(fù)3次取平均值。

1.3.5.2 人工腸液的耐受性試驗(yàn)

人工腸液的配制：將下述a液和b液以2：1混合即為人工腸液。

a胰腺液：NaHCO31.1%、NaCl 0.2%、胰蛋白酶1%，調(diào)整pH值為3.0后，過濾除菌后備用。

b膽液：豬膽鹽1.2% ，調(diào)整pH值為8.0后，過濾除菌備用。

將試驗(yàn)菌液A、B、C以10%的接種量接入到模擬腸液中，37 ℃，140 r/min搖床培養(yǎng)，分別于 0、60、120、240 min取樣，MTT法測其活菌數(shù)，并計(jì)算存活率（重復(fù)3次，取平均值）。

1.4 分析方法

1.4.1 MTT法測活菌數(shù)

此法是通過檢測光密度值變化來間接反映菌體活細(xì)胞數(shù)量的變化，只有在一定細(xì)胞濃度范圍內(nèi)，甲瓚生成量才與活細(xì)胞數(shù)目呈正相關(guān)。因此，比色前必須對培養(yǎng)液中菌體濃度進(jìn)行處理：菌液濃度過低時(shí)，濃縮后再測定；若過高時(shí)，先稀釋，使其OD值在0.2～1.0的范圍后，再測定。魏鴻剛等認(rèn)為：當(dāng)樣品中活菌濃度在1×107～1.4×108CFU/ml范圍內(nèi)時(shí)，光吸收值與待測樣品的活菌濃度之間的線性關(guān)系較好。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

①PBS溶液配制：8 g NaCl、1.15 g磷酸氫二鉀，0.2 g磷酸二氫鉀去離子水定容至1 000 ml，用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH值7.2，溶液濃度為0.01 mol/l。121℃滅菌15 min，室溫保存。

②MTT溶液配制：稱取100mgMTT于小燒杯中，加 20 ml PBS(0.01 mo/l，pH 值 7.2)，使其充分溶解，用0.22 μm微孔過濾器除菌，分裝于1.5 ml的EP管中，4℃棕色瓶中避光保存。兩周內(nèi)使用有效。

③標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取3種實(shí)驗(yàn)菌的菌液，用無菌生理鹽水進(jìn)行倍比稀釋，選擇10個(gè)合適的濃度，分別對其做MTT比色實(shí)驗(yàn)和平板菌落計(jì)數(shù)。根據(jù)OD值和活菌數(shù)作出3種實(shí)驗(yàn)菌各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程。

④MTT比色實(shí)驗(yàn)：A：將培養(yǎng)液進(jìn)行濃縮或稀釋，使其活菌濃度滿足比色要求；B：吸取處理好的培養(yǎng)液100 μl，加入96孔酶標(biāo)板中，每個(gè)樣液做5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對照；C：用微量吸樣器在96孔酶標(biāo)板中含有樣品的各孔分別加入20 μl的MTT溶液，37℃恒溫培養(yǎng)1.5 h后取出，向各孔分別加入100 μl的DMSO，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于570 nm處測定OD值，測量前振動(dòng)60 s。所得OD值代入回歸方程計(jì)算出活菌數(shù)。

1.4.2 pH值的測定

用ORION RESEARCH model 221型酸度計(jì)測pH值。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)方法

為了便于進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將活菌數(shù)CFU/ml換算成對數(shù)值。

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)用Excel2007和SPSS17.0進(jìn)行計(jì)算和分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±sd)的形式給出。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表1）

表1 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果（mm）

從表1可以看出，嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌這兩種實(shí)驗(yàn)菌對指示菌均具有一定的抑制活性。其中，對大腸桿菌抑菌活性最好的是納豆芽孢桿菌，其抑菌圈直徑為15.67 mm；對鼠傷寒沙門氏菌抑菌能力最好的也是納豆芽孢桿菌，其次是嗜酸乳桿菌，兩種菌抑菌圈大小分別為14.95和13.67 mm；混合菌液對大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌也均具有抑菌作用，其抑菌圈直徑分別為14.91和13.33 mm。說明各實(shí)驗(yàn)菌株對指示菌均有一定的抑菌效果，且兩菌種混合后對病原菌仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌作用。

2.2 耐酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

因飲食結(jié)構(gòu)等的狀況的不同，動(dòng)物胃液pH值的波動(dòng)較大，如豬胃中的pH值常在2.0～7.0之間，但一般在3.0左右，因此，以此pH值作為菌株篩選的標(biāo)準(zhǔn)。

由圖1可知，隨著培養(yǎng)基pH值的逐漸降低活菌含量也隨之下降。在pH值5.0時(shí)，各試驗(yàn)菌均表現(xiàn)出較好的增殖現(xiàn)象，嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)對數(shù)值達(dá)到了7.35。pH值4.0時(shí)，3種菌的活菌數(shù)有所下降，活菌數(shù)均小于107；當(dāng)pH值下降至3.0時(shí)，3種試驗(yàn)菌仍然表現(xiàn)一定的耐受能力，活菌數(shù)均在106左右。其中，嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌的存活能力比釀酒酵母要好。在pH值為2的強(qiáng)酸性條件下，納豆芽孢桿菌的存活能力較其余兩菌要好，活菌數(shù)在105以上。由此，說明篩選出的3種試驗(yàn)菌（尤其是納豆芽孢桿菌）均具有較好的抗酸能力，能順利通過高酸性胃液環(huán)境進(jìn)入腸道。

圖1 不同pH值對菌數(shù)含量的影響

2.3 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

微生物飼料添加劑對膽鹽的耐受性是決定其進(jìn)入豬體內(nèi)能否發(fā)揮生理功能的又一關(guān)鍵因素。膽鹽是由肝臟合成的膽汁酸與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合形成的鈉鹽或鉀鹽，經(jīng)膽道分泌進(jìn)入小腸，動(dòng)物腸道中的膽汁鹽含量是不斷變化的，一般在0.3～3.0 g/kg，通常情況下其平均含量為0.3 g/kg，所以通常將0.3 g/kg作為篩選耐膽汁鹽菌體的標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 不同膽鹽濃度對實(shí)驗(yàn)菌活菌數(shù)的影響

由圖2可知，嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌、釀酒酵母在膽鹽濃度為0.1%、0.2%時(shí)均能很好的生長繁殖，其中納豆芽孢桿菌的耐膽鹽能力較強(qiáng)，活菌數(shù)均大于107CFU/ml；當(dāng)豬膽鹽濃度增加為0.3%時(shí)，3種試驗(yàn)菌都表現(xiàn)出較好的增殖現(xiàn)象，其中納豆芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的增殖較明顯，活菌數(shù)都在106以上；當(dāng)膽鹽濃度為0.4%時(shí)，納豆芽孢桿菌生長狀況一般，而嗜酸乳桿菌和釀酒酵母的生長受到較明顯抑制，但活菌數(shù)仍大于104。說明嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌、釀酒酵母對膽鹽均具有一定的耐受力。

2.4 人工模擬豬體胃腸道耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 人工胃液的耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

動(dòng)物胃液的成分主要有：鹽酸、胃蛋白酶原、粘蛋白等。胃蛋白酶原在HCl激活下轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘奈傅鞍酌福澄?。流體食物在胃內(nèi)經(jīng)階段性運(yùn)動(dòng)消化一般需要1～2 h。菌株對胃酸及胃蛋白酶的耐受性越強(qiáng)，能夠到達(dá)腸道的活菌數(shù)越多，則越能最大限度地發(fā)揮效應(yīng)。人工模擬豬體胃液實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見表2。

由表2所示，在人工豬體胃液中，3種實(shí)驗(yàn)菌在人工胃液中的活菌數(shù)隨著時(shí)間的延長逐漸降低，作用2 h活菌存活率均在70%以上，即大部分試驗(yàn)菌耐受人工胃液環(huán)境的時(shí)間超過2 h。說明篩選出來的3種實(shí)驗(yàn)菌通過豬體胃液環(huán)境進(jìn)入腸道的可能性較大。

2.4.2 人工模擬腸液的耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

豬體消化道腸液中含有胰蛋白酶和膽汁鹽，對菌株的存活有很大的影響。小腸液是一種弱堿性液體，pH值約為7.6。食物在小腸內(nèi)停留時(shí)間較長，約3～5 h。另外，膽汁鹽具抗菌性，可溶解細(xì)菌細(xì)胞，活菌進(jìn)入腸道后，要對環(huán)境具有一定的持續(xù)耐受能力，才能保證其正常發(fā)揮作用。人工模擬豬體腸液實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，實(shí)驗(yàn)菌對人工豬體腸液具有較強(qiáng)的耐受能力，3種實(shí)驗(yàn)菌的存活率都在80%以上，耐受時(shí)間可超過5 h。其中，納豆芽孢桿菌經(jīng)人工胃液處理5 h后的存活率仍大于85%。由此說明3種實(shí)驗(yàn)菌通過豬體腸液環(huán)境存活的可能性較大。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

多數(shù)報(bào)道表明，甲瓚在570 nm下的光吸收值與細(xì)胞活性正比關(guān)系最佳，本文選取570 nm測定OD值。此外，不同益生菌的琥珀酸脫氫酶的活性各不相同，為了更精確的反映培養(yǎng)液中的活菌數(shù)，本文準(zhǔn)確地繪制了3種實(shí)驗(yàn)菌各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以MTT比色法所得OD值為X軸，以平板稀釋法所得活菌數(shù)為Y軸作標(biāo)準(zhǔn)曲線。3種菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3、圖4、圖5，3種菌的線性回歸方程為：

①嗜酸乳桿菌：線性回歸方程：y=1.497 3x+0.001 7，R2=0.984 7；

②納豆芽孢桿菌：線性回歸方程：y=1.380 5x+0.017 4，R2=0.986 7；

③釀酒酵母：線性回歸方程：y=1.484 2x+0.009 3，R2=0.985 5。

表2 實(shí)驗(yàn)菌的人工胃液實(shí)驗(yàn)（pH值為3.0）

表3 實(shí)驗(yàn)菌的人工腸液實(shí)驗(yàn)

圖3 嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)與OD570 nm的關(guān)系

圖4 納豆芽孢桿菌的活菌數(shù)與OD570 nm的關(guān)系

圖5 釀酒酵母的活菌數(shù)與OD570 nm的關(guān)系

3 討論與結(jié)語

由于豬體胃腸消化道不斷分泌胃液、膽汁、胰液等消化液，對微生物構(gòu)成一道酶和低pH值的屏障。復(fù)合益生菌需對胃腸道較強(qiáng)的酸性環(huán)境、較高濃度的膽鹽和各種消化酶具有一定的耐受能力，這樣才能保證其進(jìn)入消化道，并定植于腸道內(nèi)，發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的作用。

所選3種試驗(yàn)菌：嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌及其混合菌液對大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌均具有明顯的抑制作用，在pH值3.0時(shí)，3種實(shí)驗(yàn)菌的活菌數(shù)均在106左右，其中，嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌的酸性環(huán)境存活能力比釀酒酵母要好。在0.3%豬膽鹽的環(huán)境中，3種實(shí)驗(yàn)菌都表現(xiàn)出較好的增殖現(xiàn)象，其中納豆芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的增殖較明顯，活菌數(shù)都在106以上。另外，人工胃腸道實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：3種實(shí)驗(yàn)菌通過豬體胃液環(huán)境存活的可能性較大，3種實(shí)驗(yàn)菌在人工胃液中作用2 h活菌存活率均在70%以上；3種實(shí)驗(yàn)菌對人工豬體腸液具有較強(qiáng)的耐受能力，存活率都在80%以上，耐受時(shí)間可超過5 h。其中，納豆芽孢桿菌經(jīng)人工胃液處理5 h后的存活率仍大于85%。

由本實(shí)驗(yàn)所篩選的3種實(shí)驗(yàn)菌（嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌、釀酒酵母）均可以通過胃液到達(dá)小腸發(fā)揮作用。所選菌株對病原菌、尤其是豬體高致病菌有較強(qiáng)的抑制作用，具備了優(yōu)良益生菌的條件，我們將進(jìn)一步摸索發(fā)酵實(shí)驗(yàn)條件、研究生產(chǎn)制備工藝，制成固體微生物飼料添加劑，并將其應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中，進(jìn)行豬的飼喂實(shí)驗(yàn)，以檢驗(yàn)其應(yīng)用效果。

13篇，刊略，需者可函索）