陸琳 劉來福 劉國傳 饒紅 張紹福

(北京出入境檢驗檢疫局 北京 100026)

1 前言

結(jié)核病一直是我國各口岸檢驗檢疫機構實施衛(wèi)生檢疫的重點疾病,在出入境人員或移民體檢中進行肺結(jié)核篩查也是全球結(jié)核病防控重點工作之一。今年新修改的《中華人民共和國國境衛(wèi)生檢疫法實施細則》中規(guī)定,傳染性肺結(jié)核病是出入境人員監(jiān)測傳染病之一,世界衛(wèi)生組織呼吁對出入境人員或移民進行肺結(jié)核篩查和病人分類管理,不少國家也要求我國的出境人群必需出具結(jié)核病的檢測報告。為了控制結(jié)核病經(jīng)國境口岸的傳播,各直屬出入境檢驗檢疫局國際旅行衛(wèi)生保健中心相繼建立結(jié)核病檢測實驗室,對出入境人員及移民進行結(jié)核病的實驗室診斷[1-2]。

結(jié)核分枝桿菌在衛(wèi)生部公布的《人間傳染的病原微生物名錄》中被列為第二類病原微生物 (危害程度為Ⅲ級),屬高致病性病原微生物[3]。結(jié)核分枝桿菌有多種傳播途徑,以呼吸道吸入帶菌的飛沫及帶菌的塵埃為主要傳播途徑,也是引起實驗室感染的最主要因素。據(jù)統(tǒng)計,從事實驗的工作人員感染結(jié)核分枝桿菌的概率是其他行業(yè)工作人員的 3-9倍,結(jié)核分枝桿菌引起的實驗室獲得性感染可發(fā)生于實驗室工作人員操作的整個過程中,尤其以在操作過程中產(chǎn)生的結(jié)核分枝桿菌的氣溶膠危害最大[4]。

根據(jù)《人間傳染的病原微生物名錄》的規(guī)定,涉及結(jié)核桿菌的大量培養(yǎng)、結(jié)核桿菌離心和凍干等可產(chǎn)生氣溶膠的實驗操作及結(jié)核桿菌活菌感染的動物實驗,應在 BSL-3或 ABSL-3實驗室進行。臨床樣本的結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)、藥物敏感性實驗、生化鑒定、免疫學實驗、PCR核酸提取、涂片、顯微觀察等初步檢測活動可在 BSL-2實驗室進行。對經(jīng)有效方法滅活后不含結(jié)核桿菌活菌材料的分子生物學、免疫學等實驗可在 BSL-1實驗室進行[5]。國境口岸結(jié)核病檢測主要是對結(jié)核分枝桿菌臨床樣本的操作,可在 BSL-2實驗室進行。

目前,對于結(jié)核病檢測實驗室的實驗活動制定的檢測方法大都從檢測技術本身進行了規(guī)范,但未對實驗活動的生物安全要求進行規(guī)范。加強結(jié)核病檢測的生物安全操作規(guī)范研究,對于降低實驗室生物安全風險,確保實驗室人員生命健康、檢測結(jié)果的準確性,保障社會公共衛(wèi)生安全和環(huán)境安全等方面具有重要意義[6]。

2 結(jié)核病檢測易產(chǎn)生生物安全風險的關鍵環(huán)節(jié)及防護措施

2.1 實驗樣品的接收與開啟

風險:由臨床獲取的結(jié)核桿菌培養(yǎng)物或凍干菌種在運輸過程中可能會因試管塞子脫落或破碎;凍干菌種多為真空封口,當打開凍干物的安瓿時,因為其內(nèi)部可能處于負壓,瞬間進入的空氣可能使一些菌體產(chǎn)生氣溶膠擴散進入空氣而造成污染。

防護措施:要求接受和打開樣品的人員應當了解樣品對身體健康的潛在危害,接受常規(guī)預防措施的培訓;樣品要在生物安全柜內(nèi)打開,緩慢向安瓿中加入液體以重懸凍干物,避免出現(xiàn)泡沫;準備好消毒劑。

2.2 試驗樣品涂片

風險:用于顯微觀察的培養(yǎng)物、血液、唾液和糞便等樣品在固定和染色時可能產(chǎn)生氣溶膠;樣品的熱固定不能殺滅所有涂片標本中的結(jié)核桿菌;若涂片長時間暴露在高溫中可使殘留活菌減少,并僅見于涂片厚的部分,從而提示在熱固定時,痰液對細菌有保護作用。

防護措施:涂片操作過程應避免產(chǎn)生氣溶膠,制成涂片后立即染色可減少危險;若涂片不能及時染色,建議將涂片浸泡在戊二醛溶液中或用 Blalr氏等的方法處理以確保安全;涂片應當用鑷子拿取,恰當儲存,并經(jīng)消除污染或高壓滅菌后再丟棄。

2.3 結(jié)核桿菌接種培養(yǎng)

風險:在結(jié)核桿菌傳代、耐藥檢測、生化分型實驗以及感染動物結(jié)核桿菌再分離試驗中均要求進行結(jié)核桿菌接種培養(yǎng),在此活動中試管開封、樣品轉(zhuǎn)移、吸管吹吸、混合等步驟可能產(chǎn)生氣溶膠;在菌體轉(zhuǎn)移過程中,培養(yǎng)物制劑的濺出、潑灑和容器的破碎等也可造成嚴重污染。

防護措施:在工作臺面應當放置一塊浸有消毒液的布或吸有消毒液的紙,使用后將其高壓滅菌或按感染性廢物處理;微生物接種環(huán)的直徑應為 2～3mm并完全封閉,手柄的長度應小于 6cm以減小振動,或者采用一次性滅菌棉簽;用封閉式微型電加熱器消毒接種環(huán)能夠避免在明火上加熱所引起的感染性物質(zhì)爆濺;最好使用不需要進行消毒的一次性接種環(huán)。

2.4 實驗樣品研磨

風險:使用勻漿器時容器內(nèi)會產(chǎn)生氣溶膠;玻璃可能破碎而釋放感染性物質(zhì)。

防護措施:要求接受和打開樣品的人員應當了解樣品對身體健康的潛在危害,接受常規(guī)預防措施的培訓;樣品要在生物安全柜內(nèi)打開。

2.5 未經(jīng)滅活組織標本采集

風險:含活菌血清與細胞樣品可能造成污染;帶活菌的玻璃器皿破損、注射器的誤傷而造成血液傳播;樣品的稀釋混勻可能產(chǎn)生氣溶膠。

防護措施:樣品稀釋在生物安全柜內(nèi)進行;盡可能采用塑料器皿,注射器使用時針頭必須牢牢固定在注射器上;從帶有橡皮塞瓶中抽取微生物懸液時,應該用消毒棉球?qū)⑵靠谂c針頭圍住,以防氣溶膠逸出。

2.6 室內(nèi)空氣、實驗用品以及操作臺面污染

風險:微生物操作過程對室內(nèi)空氣、用品以及操作臺面污染。

防護措施:試驗結(jié)束后立即開啟紫外燈對操作區(qū)和實驗室進行照射消毒 2h以上;每次試驗操作終止后,必須清理好實驗臺,所有物品歸位并用 75%乙醇溶液或 3-5%石碳酸擦洗實驗臺和地面。

2.7 菌種以及培養(yǎng)物保藏

風險:手污染造成感染性物質(zhì)的食入;與皮膚和眼睛的接觸感染;原始記錄未消毒造成污染;個人防護裝備未徹底消毒而造成污染。

防護措施:實驗室人員在操作時應戴一次性手套,并避免接觸口、眼及面部;實驗結(jié)束后,操作人員要仔細的用肥皂和清水將雙手洗凈;在任何可能導致潛在傳染性物質(zhì)濺出的操作過程中,應采取防護措施保護面部、口和眼。

3 結(jié)核病檢測的生物安全操作

3.1 標本容器

標本容器應是玻璃和塑料制品,堅固,加蓋或加塞蓋好后應無泄漏;容器上應粘貼標簽以便于識別,外部不應有殘留物;標本的要求和說明書不應卷在容器外面,應該分開放在防水的袋子里;痰標本采用世界衛(wèi)生組織 (WHO)推薦的國際通用螺旋蓋痰瓶或可密封塑料盒、蠟紙盒收集 (參考規(guī)格:直徑 4cm,高度 2cm)。

3.2 樣本采集

應遵循專業(yè)防護方法,所有操作均應戴手套、口罩;應由受過專業(yè)培訓的人員采集病人的樣本;由于當患者咳嗽、咳痰時,易產(chǎn)生含有結(jié)核菌的氣溶膠,感染周邊人群的幾率較高,故采集痰標本時應在遠離人群的開放空間,或通風良好的室內(nèi)進行;在靜脈抽血時,應使用一次性的安全真空采血管取代傳統(tǒng)的針頭和注射器,使血液直接采集到帶塞的運輸管和 (或)培養(yǎng)管中,用完后自動廢棄針頭。

3.3 標本接收

接收標本的實驗室應安排專門的標本接收通道;通道內(nèi)應安裝紫外燈,備有消毒劑。

3.4 打開包裝

接收和打開標本的人員應了解標本對身體健康的潛在危害,并接受過專業(yè)防護的培訓;標本的內(nèi)層容器應在生物安全柜內(nèi)打開,并準備好消毒劑。

3.5 打開標本管和取樣

應在生物安全柜內(nèi)打開標本管;應戴手套,并對眼睛和粘膜進行保護 (護目鏡或面罩)。

3.6 樣品涂片

涂片操作過程應避免產(chǎn)生氣溶膠,制成涂片后立即染色可減少危險;若涂片不能及時染色,建議將涂片浸泡在戊二醛溶液中或用 Blalr氏等的方法處理以確保安全;涂片應當用鑷子拿取,恰當儲存,并經(jīng)消除污染或高壓滅菌后再丟棄。

3.7 避免吸入或接觸感染性物質(zhì)

實驗室人員在操作時應戴一次性手套,并避免接觸口、眼及面部;嚴禁在實驗室內(nèi)飲食以及儲存食品和飲料;在實驗室,工作人員嘴里不應有任何東西 (筆、口香糖);不應在實驗室化妝和裝卸角膜接觸鏡。

3.8 避免感染性物質(zhì)的注入

應避免被破損玻璃器皿刺傷所引起的接種感染;盡量以塑料器皿和吸管代替玻璃器皿和吸管;銳器損傷時 (如通過皮下注射針頭、玻璃吸管及破碎的玻璃),應防止意外注入感染性物質(zhì);減少使用注射器和針頭,如可用簡單工具打開瓶塞,然后用吸管取樣;一次性物品應丟棄在專用的防/耐穿透的帶蓋容器中。

3.9 防止感染性物質(zhì)的擴散

微生物接種環(huán)的直徑為 2～3mm,并完全封閉,柄的長度不應超過 6cm,以最大限度的減小抖動,防止被接種物灑落;被處理的廢棄標本和培養(yǎng)物,應放置在防漏的容器內(nèi) (實驗室廢棄物袋),在丟棄到廢棄物盛器中前,采用高壓滅菌膠帶將頂部固定好,然后進行高壓滅菌;工作結(jié)束后,應采用適當?shù)南緞┣宄ぷ鲄^(qū)的污染。

3.10 標本的傳遞與運輸

標本在設施內(nèi)的傳遞應符合下列要求:

(1)裝有標本的容器應保持直立,避免意外泄露或溢出;

(2)容器應是金屬或塑料制品,能耐高壓滅菌 /化學消毒劑的作用;

(3)應定期清除污染。

4 結(jié)核病檢測主要生物安全儀器設備的選用、使用和維護

4.1 生物安全柜的選用、使用和維護

4.1.1 選用

生物安全柜是在操作原代培養(yǎng)物、菌毒種及診斷性標本等具有感染性的實驗材料時,用來保護操作者、實驗室環(huán)境及實驗材料,使其避免暴露于上述操作過程中可能產(chǎn)生的感染性氣溶膠和濺出物而設計的安全設備。國境口岸結(jié)核病檢測主要是對結(jié)核分枝桿菌的臨床樣本進行操作,根據(jù)其生物安全風險,從保護人員和實驗對象的角度考慮,建議選用Ⅱ級生物安全柜 (即氣溶膠經(jīng) HEPA過濾器過濾后,一部分排放出去,一部分再次循環(huán)進入安全柜內(nèi),其中:前部開口區(qū)的吸入氣流用以保護操作者的安全,經(jīng) HEPA過濾的垂直氣流用以保護樣本,排出的氣流經(jīng) HEPA過濾是為了保護環(huán)境),尤其不能使用超凈工作臺來代替生物安全柜。

4.1.2 使用

(1)生物安全柜在使用中不能打開玻璃觀察擋板。

(2)生物安全柜內(nèi)應少放置器材或標本,以免影響后部壓力排風系統(tǒng)的氣流循環(huán)。

(3)生物安全柜內(nèi)不應使用本生燈,防止燃燒產(chǎn)生的熱量干擾氣流,損壞過濾器;應使用微型電加熱器。

(4)所有工作應在工作臺面的中后部進行,并能通過玻璃觀察擋板觀察。

(5)操作者不應反復移出和伸進手臂以免干擾氣流。

(6)工作完成后及下班前,應用消毒劑對生物安全柜的表面進行擦拭。

(7)工作開始前和結(jié)束后,安全柜的風機應運行 10 min以上。

(8)所有進入和移出該系統(tǒng)的物品應通過連接的消毒設備進行消毒。

4.1.3 維護

應定期用 70%醫(yī)用酒精擦拭消毒安全柜的內(nèi)壁和臺面,保持清潔;當生物安全柜被污染后,可用甲醛、過氧化氫熏蒸法消毒;每年需要檢查和更換消毒用紫外燈;每年應更換一次 HEPA過濾器;定期對生物安全柜進行檢測或檢定。

4.2 高壓滅菌器的選用、使用和維護

4.2.1 選用

因為結(jié)核病檢測實驗室涉及高致病性病原微生物操作,因此實驗室對實驗器械、試劑以及廢棄物必須進行高壓滅菌。目前使用比較普遍的高壓滅菌器是高壓蒸汽滅菌器,具有溫度高、熱穿透力強,滅菌效果好等特點[7]。

4.2.2 使用

(1)高壓滅菌器屬于一類壓力容器,是涉及生命安全、危險性較大的特種設備之一,國家早已頒布了有關的法規(guī)標準,操作人員應定期參加專門的技術培訓,做到持證上崗。

(2)在使用高壓滅菌器時嚴禁超溫超壓運行,應緩慢地加載和卸載,做到“四慢一穩(wěn)”,即慢升溫慢升壓慢降壓慢降溫,恒溫操作時工藝參數(shù)穩(wěn)定。

(3)嚴禁帶壓操作,并注意裝載容量,下排氣滅菌器的裝載量不得超過壓力容器內(nèi)容量的 80%,預真空滅菌器的裝載量不得超過 90%且不能小于容器內(nèi)容量的 10%,以防止“小裝量效應”。

4.2.3 維護

按照國家質(zhì)量技術監(jiān)督主管部門規(guī)定,必須定期對高壓滅菌器進行定期檢驗,包括外部檢驗、內(nèi)部檢驗和耐壓試驗。

4.3 離心機的選用、使用和維護

4.3.1 選用

離心機是借離心力分散液相非均一體系的設備,它根據(jù)物質(zhì)的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度等的不同,應用強大的離心力使物質(zhì)分散、濃縮和提純。結(jié)核病檢測實驗室應盡可能選用配備密封吊桶、轉(zhuǎn)子的生物安全型離心機。

4.3.2 使用

(1)離心機應當放在低于使用者能看到離心腔的平均高度位置,以便能夠準確的安裝轉(zhuǎn)頭和離心吊桶。

(2)離心管和盛放離心標本的容器應由厚壁玻璃 (塑料)制品制成,并且在使用前應檢查是否破損,使用時應用螺旋蓋牢固蓋緊。

(3)離心桶的裝載、平衡、密封和打開應在生物安全柜內(nèi)進行。

(4)離心桶和十字軸應按質(zhì)量配對,并在裝載離心管后正確平衡。

(5)當使用固定角離心轉(zhuǎn)子時,離心管不能裝得過滿,以防漏液。

4.3.3 維護

應在使用前檢查離心機內(nèi)轉(zhuǎn)子部位的腔壁有無被污染。應檢查離心轉(zhuǎn)子和離心桶無腐蝕和細微裂痕。每次使用后,應清除離心桶、轉(zhuǎn)子和離心機腔的污染,應將離心桶倒置存放使平衡液流干。應定期清理離心管座,定期清洗離心杯,并用消毒劑清除污染。

[1] Global Tuberculosis Control:A short update to the 2009 report WHO,2009.

[2] Castro C,González L,Rozo JC,et al.Biosafety evaluation of the DNA extraction protocol for Mycobacterium tuberculosis complex species[J].Biomedica,2009,,29(4):561.

[3] 劉國傳,劉來福,張利峰,等.檢驗檢疫病原微生物實驗室的生物安全[J].檢驗檢疫學刊,,2009,3:20.

[4] 張利峰,劉來福,饒紅,等.檢驗檢疫動物病原微生物實驗活動生物安全要求的分析研究[J].檢驗檢疫學刊,2009,5:12.

[5] 馬虹,楊修軍,隋達偉,等.病原微生物實驗室的生物安全管理[J].中國衛(wèi)生工程學,2010,2:32.

[6] 劉來福主編.病原微生物實驗室生物安全管理和操作指南[M].北京:中國標準出版社,2010.

[7] 王君瑋,王志亮,呂京.二級生物安全實驗室建設與運行控制指南[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2009.