徐 海 陳 斌 金華嶺 徐 剛 張新江

江蘇揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 揚(yáng)州 225000

NSCs是指存在于神經(jīng)系統(tǒng)中特定的前體細(xì)胞,其基本的生物學(xué)特征為多向分化和自我更新,獨(dú)特的生物學(xué)特性使其較其他細(xì)胞更容易在新的環(huán)境中生存,發(fā)揮生物學(xué)作用。神經(jīng)干細(xì)胞一直被認(rèn)為是細(xì)胞替代治療帕金森病的理想載體,但是神經(jīng)干細(xì)胞如何分化為具有功能的多巴胺能神經(jīng)元一直是個(gè)難題。Pitx3[1-2]稱(chēng)為垂體同源盒家族因子3,是決定中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元表型、終末分化和生存維持的關(guān)鍵性特異性轉(zhuǎn)錄因子,TH是DA合成限速酶通常作為DA能神經(jīng)元的特異性標(biāo)志,表達(dá)情況是神經(jīng)干細(xì)胞能否轉(zhuǎn)化為多巴胺能神經(jīng)元的關(guān)鍵。因此,本文探討胚胎大鼠腹側(cè)中腦區(qū)域NSCs的培養(yǎng)過(guò)程中pitx3,TH以及凋亡基因的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:E14.5 d的胚胎大鼠由東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:DMEM/F12(1∶1)(Dulbecco's Modified Eagle Medium,F12 Nutrient Mixture,Gibco公司),N2,無(wú)血清培養(yǎng)液添加劑B27(B27 Supplement,Gibco公司)。表皮生長(zhǎng)因子EGF(epidiermal growth factor,EGF,Gibco公司),堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor-Basic,bFGF,Gibco公司).胎牛血清(fetal bovine serum,gibco)小牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA,Cat.No.A3156),RNA提取試劑盒(QENGEN),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Product No.205213,Qiagen,Germany),Lightcycler system(Roche Diagnostics,Switzerland)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備:CO2培養(yǎng)箱(日本三洋)、醫(yī)用超凈工作臺(tái)(吳江市凈化設(shè)備總產(chǎn),凈化等級(jí)100級(jí))、體視顯微鏡(OLYMPUS-CK2)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原代克隆的培養(yǎng):取E14.5 d妊娠SD大鼠,嚴(yán)格消毒大鼠的腹部皮膚,在劍突下剪開(kāi)皮膚至下腹部,取出胚胎,將其放入無(wú)菌冰凍D-Hank's液中,小心分離腦組織,在解剖鏡下剔除腦膜和血管,鈍性分離中腦組織。將分離出來(lái)的中腦組織充分剪碎,置于細(xì)孔尼龍網(wǎng)中,用玻璃試管底輕輕碾磨,再通過(guò)70μm孔徑的尼龍網(wǎng)過(guò)濾,并用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液。室溫1000 r/min離心5 min。棄上清,加入增殖培養(yǎng)基中,按細(xì)胞濃度1×105接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),置于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基的基本成分為DMEM/F12(1∶1)1%N2,1%B27,EGF 20 ng/mL,bFGF 20 ng/mL,培養(yǎng) 4～5 d后加入1 mL新鮮培養(yǎng)液,8～9 d后觀察生長(zhǎng)的懸浮神經(jīng)細(xì)胞球的大小和數(shù)目。

1.2.2 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn):將傳至第二代的細(xì)胞球懸液用毛細(xì)吸管從培養(yǎng)瓶中吸出,轉(zhuǎn)入10 mL離心管中,將離心管靜置10 min,待細(xì)胞球沉入管底后吸去上清液。將細(xì)胞球吸出,用吸管吹打成單細(xì)胞懸液,用臺(tái)盼藍(lán)法鑒定細(xì)胞活性,用無(wú)血清培養(yǎng)液將單細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度稀釋成40個(gè)細(xì)胞/μL,將上述稀釋好的單細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中,每孔50 μL,另加完全培養(yǎng)液100μL,置于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng),2 h后在倒置顯微鏡下觀察。選取僅有1個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔作標(biāo)記,每天在倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察所標(biāo)記的孔中細(xì)胞的分裂及克隆形成情況。

1.2.3 細(xì)胞RNA的提取并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA:取傳代前的細(xì)胞克隆作為對(duì)照組。在單細(xì)胞克隆形成的7、14、21 d分別收集懸浮細(xì)胞,RNA試劑盒按說(shuō)明步驟提取細(xì)胞總RNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA在260 nm和280 nm兩個(gè)波長(zhǎng)的吸光度,并根據(jù)OD值定量。各個(gè)樣本分別取10μL RNA,以O(shè)ligo(d T)作為引物,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)步驟加入相應(yīng)底物和酶,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.4 Real-time PCR反應(yīng):本試驗(yàn)所用為Real-time PCR系統(tǒng)為 Lightcycler系統(tǒng),β2-Microglobulin為內(nèi)參。見(jiàn)表 1。Real-time PCR反應(yīng)所用試劑見(jiàn)表2。

表1 所用的相關(guān)引物

表2 Real-time PCR反應(yīng)所用試劑及用量

圖1 pitx3 Reaal-time PCR結(jié)果

1.2.5 數(shù)據(jù)分析處理:所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以保證結(jié)果的可靠性。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取3組細(xì)胞克隆,Real-time PCR結(jié)果取平均值。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果與對(duì)照組做比較(以百分?jǐn)?shù)表示),對(duì)照組的結(jié)果設(shè)為1。最后的結(jié)果取 3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 單細(xì)胞克隆 見(jiàn)圖1。原代培養(yǎng)的NSCs在培養(yǎng)最初的3～4 d,可見(jiàn)培養(yǎng)瓶底有許多小圓形死亡細(xì)胞及其碎片,大部分存活細(xì)胞在培養(yǎng)液中懸浮,10 d左右形成含有上百個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞球。體外培養(yǎng)8～9 d后將神經(jīng)細(xì)胞球機(jī)械吹散成單細(xì)胞懸液,置于同樣條件下培養(yǎng)?？捎^察到懸浮的單個(gè)細(xì)胞分裂增殖并形成細(xì)胞小球。細(xì)胞球可以進(jìn)一步增長(zhǎng),形成近百個(gè)無(wú)突起、形態(tài)和大小基本相似的細(xì)胞組成的神經(jīng)球。

2.2 Real-time PCR反應(yīng)結(jié)果 見(jiàn)圖2。

圖2 pitx3、Bax和Bcl-2基因表達(dá)

3 討論

目前,在成年哺乳動(dòng)物中,先后在SVZ區(qū)、紋狀體、海馬齒狀回和脊髓中分離得到NSCs。但人們研究發(fā)現(xiàn),不同部位分離得到的NSCs其生長(zhǎng)速度、分化方向、遷移特性等生物學(xué)特征有很大的不同[3]。關(guān)于mNSCs的研究多集中在DA能神經(jīng)元表型的誘導(dǎo)上,在過(guò)去數(shù)年的研究中表明它們?cè)诜只T導(dǎo)的遺傳學(xué)和分子調(diào)控及DA能神經(jīng)元表型成熟等許多方面都具有自己的特征性[4]。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子pitx3和TH在多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[5]。因此本文選取胚胎大鼠腹側(cè)中腦區(qū)域進(jìn)行NSCs的培養(yǎng),觀察pitx3、TH以及凋亡的相關(guān)基因進(jìn)行研究,為細(xì)胞移植治療PD的應(yīng)用研究打下基礎(chǔ)。

研究表明,干細(xì)胞在腦中所處的部位已經(jīng)預(yù)定其發(fā)育特征因而表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)和分化特性。例如室管膜周?chē)腘SCs,很早即被決定了特定的發(fā)育方向,這也是為何最先發(fā)育成型的是脊髓,隨后是延髓、腦橋、中腦、間腦、再次是端腦,最后是小腦。由于DA能神經(jīng)元主要存在于腹側(cè)中腦,因此人們推測(cè)在此區(qū)域的NSCs更容易分化為DA能神經(jīng)元,以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。近年來(lái),人們發(fā)現(xiàn)和DA能神經(jīng)元發(fā)育密切相關(guān)的基因(內(nèi)源性信號(hào)),如Enl、Otx2、pitx3、Nurrl、Lmx1b、Shh、FGF8 等,在大鼠胚胎 E14.5 d時(shí),已經(jīng)表達(dá)在腹側(cè)中腦的NSCs上[5],也就是說(shuō),這些NSCs已經(jīng)含有中腦源性的轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)的發(fā)育信號(hào),能迅速對(duì)相關(guān)區(qū)域性的分子信號(hào)作出反應(yīng)從而分化為DA能神經(jīng)元。

在本實(shí)驗(yàn)中我們選擇的培養(yǎng)體系中NSCs生長(zhǎng)迅速,狀態(tài)良好,細(xì)胞數(shù)量得以大量擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,在培養(yǎng)過(guò)程中,pitx3基因的表達(dá)從7～21 d呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì),并且促進(jìn)凋亡的基因Bax也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì),并伴隨著抑制凋亡的基因Bcl-2表達(dá)的下調(diào)。結(jié)果說(shuō)明,胚胎大鼠腹側(cè)中腦源性神經(jīng)干細(xì)胞具有分化為中腦多巴胺能神經(jīng)的潛能,但同時(shí)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),調(diào)亡的細(xì)胞也在不斷增加[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道在此種培養(yǎng)條件下細(xì)胞隨著傳代次數(shù)的增加,細(xì)胞的活力逐漸減弱,凋亡的細(xì)胞大量增加。因此,在選擇培養(yǎng)的NSCs進(jìn)行移植時(shí),不僅要考慮到細(xì)胞高表達(dá)pitx3和TH基因,同時(shí)也要盡量減少細(xì)胞的凋亡以保證移植效果[7]。

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