白建梅 劉宏志 譚 軍

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院神經內科 新鄉(xiāng) 453003 2)天津市第一中心醫(yī)院內科 天津 300011 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院神經內科 新鄉(xiāng) 453003

腦血管疾病(cerebrovascular disease,CVD)尤其是缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascu lar diseases,ICVD)是神經系統(tǒng)常見病及多發(fā)病。腦缺血再灌注損傷可導致多種因素引起神經細胞死亡,因此采用神經保護劑減輕腦缺血再灌注損傷日益受到人們的重視。眾多實驗研究表明,腺苷具有腦保護作用。本實驗運用腺苷進行預處理,觀察腦缺血再灌注后腦組織病理變化,應用免疫組化方法觀察對Bax蛋白表達的影響,進一步揭示腺苷的腦保護作用機制,為臨床治療提供一條思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠60只,體質量(270±20)g,由新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心提供。隨機分為假手術組(F組)、缺血再灌注組(IR組)、腺苷預處理組(AP組),每組20只,依術后處死動物時間的不同,每組再分為4個亞組:2 h、6 h、24 h 和 72 h 組(F 2、6、24、72 h,IR 2、6、24、72 h,AP 2、6、24、72 h),每個亞組5只動物。假手術組和缺血再灌注組于手術前3 d經腹腔注射生理鹽水2 mL,1次/d,共3次。腺苷預處理組術前3 d經腹腔注射腺苷注射液,1.5 mg?kg-1,生理鹽水稀釋至2 mL,1次/d,共3次。

1.2 主要藥品及主要試劑 腺苷注射液(adenosine injection)主要成分為腺苷(化學名稱為 6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9-H-嘌呤:6 mg/2 mL),批準文號:國藥準字H 20030320,生產廠家:沈陽光大制藥有限公司。Bcl-2抗體購于Santa C ruz Biotechno logy.Inc;PV-6001免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司 。

1.3 缺血再灌注模型建立[1]10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉大鼠,暴露并分離左側頸總動脈(CCA)、頸外(ECA)和頸內(ICA)動脈,電凝頸外動脈的分支甲狀腺上動脈、咽升動脈、ICA與ECA間的交通動脈,結扎ICA分支翼腭動脈(PPA)。將前端涂有指甲油的尼龍線由ECA插入,經CCA入ICA。尼龍線插入深度(18.5±0.5)mm。缺血2 h后將栓線拉出至ECA實現(xiàn)再灌注。假手術組除不插線栓外,其余步驟同上。實驗中保持大鼠體溫(37±0.5)℃至蘇醒。

1.4 病理觀察 各組大鼠用10%水合氯醛(0.17 mL/100 g)深麻醉后,先以生理鹽水再以4%多聚甲醛快速心臟灌注,取視交叉前后各2 mm的腦組織塊在多聚甲醛中固定、脫水透明,石蠟包埋后切片,片厚 4μm,行HE染色,光鏡觀察。其余腦組織切片行Bax免疫組化染色。

1.5 Bax免疫組化檢測 步驟:(1)將烤好的切片脫蠟、水化。(2)胰蛋白酶修復液進行抗原修復30 min。(3)3%H2O2,室溫孵育10 m in。(4)滴加一抗(Bax 1∶150),4℃過夜。(5)滴加生物素標記的二抗,室溫下孵育30 m in。(6)DAB顯色。(7)蒸餾水終止反應,封片。Bax陽性細胞的胞漿染成棕黃色。應用HPIAS-2000顯微圖像處理系統(tǒng)采集圖片,每張切片隨機取5個高倍鏡視野(400×),計數(shù)Bax陽性細胞數(shù),取其平均值。

2 結果

2.1 HE染色病理觀察 光鏡下假手術組腦組織皮層內未見壞死區(qū)域,神經元和神經膠質細胞結構、形態(tài)正常,間質致密無水腫。缺血再灌注組大鼠腦組織顯示大腦皮質有壞死區(qū),壞死區(qū)可見大量變性死亡的神經元、神經元層次排列紊亂,較多呈篩狀壞死的壞死灶,神經細胞明顯減少,殘存神經細胞胞體縮小變形,核固縮,神經元纖維疏松,間質水腫明顯。腺苷預處理組大鼠右側腦組織顯示病灶皮質染色稍淺,神經元結構完整,形態(tài)基本正常,間質水腫較輕。

光鏡觀察可以看出,假手術組見神經細胞形態(tài)正常,無損傷的形態(tài)學表現(xiàn);缺血再灌注組神經細胞損傷嚴重,腺苷預處理組較缺血再灌注組損傷輕,說明腺苷預處理可以減輕大鼠腦缺血再灌注損傷區(qū)神經細胞損傷的程度,對神經細胞損傷有保護作用。

圖1 缺血再灌注組6 h Bax陽性細胞×200

圖2 腺苷預處理組6 h Bax陽性細胞×200

圖3 缺血再灌注組24 h Bax陽性細胞×200

圖4 腺苷預處理組24 h Bax陽性細胞×200

2.2 Bax免疫組化結果 陽性結果:Bax陽性細胞胞漿中有棕黃色顆粒表達。陰性對照:在腦組織壞死區(qū)及缺血半暗帶區(qū)均未見有棕黃色顆粒表達的Bax陽性細胞。F組缺血中心區(qū)僅見微量的Bax表達。IR組再灌注2 h腦組織缺血中心區(qū)可見棕黃色顆粒的Bax陽性細胞明顯表達。隨后逐漸增多,于24 h表達水平最高;隨著再灌注時間延長,Bax表達開始減少,但仍保持較高水平。見圖1、2。AP組再灌注2 h腦組織缺血中心區(qū)可見棕黃色顆粒的Bax開始表達,24 h達高峰;隨后逐漸減弱。見圖3、4。各時間點Bax陽性細胞表達均低于IR組。見表1。

表1 不同時間各組大鼠腦組織內Bax的表達(±s)

表1 不同時間各組大鼠腦組織內Bax的表達(±s)

注:與F組比較,●P＜0.05;與 IR組比較,□P＜0.05;IR和AP組同一組內各時間點比較,■P＜0.05

組別 2 h 6 h 24 h 72 h F 組 2.80±0.837 2.40±0.548 2.40±1.140 2.60±1.140 IR 組 12.20±2.387●癇 17.80±3.114●癇 32.40±1.817●癇 23.00±3.536●癇AP 組 6.80±1.483●□癇 11.60±2.702●□癇 23.20±2.280●□癇 15.80±1.643●□癇

Bax陽性細胞胞漿中有棕黃色顆粒表達,主要分布在缺血中心區(qū),且各組大鼠腦組織Bax陽性細胞表達不同,假手術組表達不明顯,缺血再灌注組表達較高,腺苷預處理組逐漸較少。同一時間點Bax陽性細胞細胞表達IR組和AP組與F組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);AP組與IR組比較有顯著差異(P＜0.05);同一組內各時間點比較,F組各亞組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),IR組和AP組組內兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖5。

圖5 Bax蛋白的表達

3 討論

缺血再灌注損傷是臨床上常見的基本病理生理過程,人們對它進行了大量的相關研究[2-4]。腦缺血可誘導腺苷釋放,與A 1受體結合導致K-ATP通道開放可能參與腦缺血預處理(cerebral ischemic preconditioning,CIP)的形成[5]。腺苷能抑制興奮性氨基酸的釋放,降低細胞膜對鈣離子的通透性,擴張腦血管,抑制炎性細胞黏附和浸潤,抑制血小板聚集,減輕炎性細胞、自由基介導的血管內皮損傷,其作用是受特異性腺苷受體調節(jié),腺苷受體分為 A1、A2、A 3三種。在全腦-全腦模式中預處理時藥物阻斷A1受體或K-ATP通道能阻斷IP的誘導。CIP對大鼠海馬神經元的缺血再灌注保護作用接近100%,而應用腺苷A1受體拮抗劑可以完全阻斷CIP的保護作用,因此推測CIP通過腺苷A 1受體介導。

腺苷或谷胱甘肽預先注入大鼠靜脈可明顯增加大鼠心臟、肝臟ATP含量,減少自由基生成,提高動物存活率[6]。心臟和腦缺血預處理的保護作用具有相似性,均為促進內源性腺苷釋放誘導CIP樣保護作用。本實驗光鏡觀察到預處理組腦部損傷輕,證實局灶性腦缺血再灌注時應用腺苷可明顯減輕腦組織的不可逆損害,再次表明腺苷具有確切的腦保護作用。

最新研究表明腦缺血再灌注損傷與細胞凋亡及其調控基因密切相關。在神經系統(tǒng),現(xiàn)已知與凋亡相關的基因基本上分為兩大類[7]:一類是促進細胞凋亡的基因,如 Bax、BalxS、cFos等;另一類是抑制凋亡的基因,如 Bcl-2和 BclxL等。Bcl-2家族中的成員共同調節(jié)細胞凋亡[8]。其中兩種主要的調節(jié)基因即Bcl-2基因和Bax基因表達的變化被眾多學者認為是腦缺血后細胞凋亡的主要分子機制[9]。Bcl-2是重要的抗凋亡基因,Bax則是與之拮抗的促凋亡基因,實驗發(fā)現(xiàn)這兩種基因的相應蛋白質產物即Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達的變化對凋亡的進程有著直接影響。

Bax是一種由192個氨基酸殘基組成的,相對分子質量為21000的蛋白質,與Bcl-2的同源性為21%,但Bax與Bcl-2的作用完全相反,Bax的表達并不立即導致細胞凋亡,而是僅在細胞接受死亡信號之后Bax才開始發(fā)揮作用,通過抑制Bcl-2的作用而導致細胞凋亡。Bcl-2屬于拮抗細胞凋亡的基因,它既能阻抑壞死又能阻抑凋亡[10-11],而這兩種死亡又是腦缺血損傷的主要形式。在本實驗研究中,大鼠局灶性腦缺血及再灌注2 h促凋亡基因蛋白Bax開始表達,再灌注6 h明顯增高,至24 h達到高峰,幾乎在相同的時間和相同的腦區(qū),Bax陽性神經元變性程度重,形態(tài)變化大,提示Bax參與了缺血后神經元凋亡的過程。同時我們還可以發(fā)現(xiàn)用腺苷預處理后大鼠腦組織促凋亡蛋白Bax明顯減少;與假手術組和缺血再灌注組相比,腺苷預處理組各時間點Bax蛋白表達減少顯著(P＜0.05)。結果表明應用腺苷進行預處理可以明顯降低促凋亡基因Bax蛋白的表達,從而發(fā)揮腦保護作用,提示腺苷用于腦缺血治療具有廣泛前景。

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