田明秀,陳加俊,趙 靜,黃艷蘋

(1.吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,吉林長春 130021;2.天津市人民醫(yī)院;3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

電針治療對大鼠局灶性腦缺血酪氨酸羥化酶表達(dá)的影響

田明秀1,2,陳加俊3*,趙 靜3,黃艷蘋3

(1.吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,吉林長春 130021;2.天津市人民醫(yī)院;3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

目的通過對電針治療后大鼠局灶性腦缺血模型(MCAO)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)表達(dá)改變的觀察,探討電針對腦可塑性的影響。方法將大鼠隨機(jī)分為對照組(正常大鼠)、實(shí)驗(yàn)組(局灶性腦缺血的大鼠)、治療組(局灶性腦缺血的大鼠+針刺),采用熒光定量RT-PCR技術(shù)觀察各組大鼠TH的動態(tài)變化。結(jié)果治療組大鼠TH活性比實(shí)驗(yàn)組有顯著提高呈陽性表達(dá)(P＜0.01),并已接近對照組的正常大鼠。結(jié)論大鼠局灶性腦缺血經(jīng)針刺治療后可增強(qiáng)TH活性,改善局灶性腦缺血癥狀,可能是針刺治療腦缺血的機(jī)理之一,提示針刺可增強(qiáng)腦可塑性。

針刺;腦缺血;酪氨酸羥化酶(TH);RT-PCR

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0034)

在腦血管病中,以缺血性疾病的發(fā)病率居首位及其防治。缺血性腦損傷的機(jī)理以及如何預(yù)防和治療一直是該研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。在缺血性腦損傷的研究過程中人們發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元對缺血有不同的敏感性。如海馬區(qū)的錐體細(xì)胞對缺血最為敏感。缺血可導(dǎo)致神經(jīng)元的變性、脫失、死亡。已研究證實(shí)由于缺血缺氧刺激神經(jīng)元可出現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的變化、海馬突觸網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu)[1]、腦內(nèi)酶的變化[2]、第二信使的改變[3]、某些基因的改變[4]、微血管系統(tǒng)的改變、病灶周圍及病灶低級或高級部位的代償、離子通道的改變、潛伏通路和突觸的起用和軸突芽生等變化,這些變化導(dǎo)致病變系統(tǒng)內(nèi)重組;而且在缺血缺氧后還會出現(xiàn)對大腦半球的代償,不同系統(tǒng)的潛伏通路和突觸的啟用,不同系統(tǒng)產(chǎn)生的行為代償,這些變化及病變系統(tǒng)間的重組共同影響了缺血后腦的可塑性。兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)參與多種生理代謝活動,包括睡眠、體溫調(diào)節(jié)、精神活動和情緒反應(yīng)等。酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是哺乳動物體內(nèi)兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)生物合成途徑的限速酶。大量的實(shí)驗(yàn)表明,腦組織缺血時,腦內(nèi)兒茶酚胺代謝發(fā)生紊亂以及酪氨酸羥化酶的表達(dá)發(fā)生變化。本實(shí)驗(yàn)通過系統(tǒng)觀察電針治療前后大鼠局灶性腦缺血模型(MCAO)神經(jīng)元酪氨酸羥化酶表達(dá)的改變,旨在研究腦梗死后腦可塑性的物質(zhì)基礎(chǔ),機(jī)制及與行為學(xué)的關(guān)系,并對電針對腦可塑性影響的機(jī)理進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 模型制備與分組

實(shí)驗(yàn)用純系Wistar大鼠,雌雄不拘,體重200-300 g,全部實(shí)驗(yàn)用大鼠均由長春市高新技術(shù)開發(fā)區(qū)動物繁殖中心提供。采用大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)法誘導(dǎo)出經(jīng)典大鼠局灶性腦缺血模型。術(shù)后隨機(jī)分組,每24只為一組,分為實(shí)驗(yàn)組(局灶性腦缺血的大鼠)、治療組(局灶性腦缺血的大鼠+針刺)。以上兩組與對照組(正常大鼠)各分成四個時間點(diǎn),分別為 6 h、24 h、3 d、7 d。提取各組各時間段的大鼠腦組織。

1.2 電針方法

治療組動物清醒后立即給予針刺,其中,雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴及雙側(cè)足三里穴加電針,強(qiáng)度以大鼠肢體顫動為度,百會穴施以平補(bǔ)平瀉法,以醫(yī)生手下感到沉緊為度。

1.3 儀器及試劑

主要實(shí)驗(yàn)儀器:超速低溫離心機(jī):Germany Heraeus;紫外分光光度儀:上海第三分析儀器廠;PCR儀:America BIO-RAD company;水平電泳儀:北京六一儀器廠;紫外透射反射檢測分析儀:上海復(fù)生生物工程研究所;數(shù)碼照相機(jī):SEAGULL DF-2。主要實(shí)驗(yàn)試劑 :RNA提取試劑盒:(Promega產(chǎn)品);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒:(MBI產(chǎn)品);Tag pluIDNA聚合酶:(Sangon產(chǎn)品);DNA-Marker;瓊脂糖;DEPC;飽和酚等以上試劑均購自寶生物工程有限公司。TH、β-actin引物序列:TH:正義鏈 5′ATGCCCAC-CCCCAGCGCCTC-3′;反義鏈 5′CTGACACTTTCCTTGGAACCA-3′;擴(kuò)增片段長度 517 bp;內(nèi)參照 β-actin;正義鏈鏈 5′-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3′;反義鏈 5′-TCATGAGGTAGTCAGTCAGG-3′;擴(kuò)增片段長度305 bp;以上引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 提取總RNA 采用異硫氰酸胍法。取冰凍組織(0.1-0.2 g)剪碎后加入異硫氰酸胍變性液2 ml(100 mg/1 ml),冰上勻漿后 ,分裝 ,每管各 500 μ l。每管依次加入50 μ l 2 mmol/L的乙酸鈉;500 μ l水飽和酚;氯仿/異戊醇(24∶1)100 μ l,冰浴操作 ,充分混勻,4℃孵育15 min。12 000 rpm,4℃離心20 min,小心移上層水相至另一新的EP管中;加等量的異丙醇,-20℃沉淀1 h;4℃,10 000 rpm離心10 min。棄上清 ,懸 RNA 于 75%乙醇150 μ l中 ,振蕩,室溫孵育10 min;4℃,10 000 rpm離心 5 min;棄上清,總 RNA干燥至透明前。依據(jù)總RNA量多少加20-40 μ l不等的0.1%焦碳酸二已酯(DEPC)溶解RNA。用紫外分光光度儀測總RNA的產(chǎn)量,純度及濃度(波長260 nm/280 nm)。

1.4.2 cDNA的合成 據(jù)總RNA的濃度取適量的總RNA,使逆轉(zhuǎn)錄的總RNA 量為8 μ g,先65℃水浴10 min,RT反應(yīng)液中依次加入5×Reaction buffer 4 μ l;20 U/μ l Ribonuclease inhibitor1μ l;2.5 mM dNTPs 2 μ l;100 μ g/mlOli(dT)18 1 μ l;100 U/μ l AMV 2 μ l;總 RNA2-4 μ l;加 0.1%DEPC 水至總體積 20 μ l。將上述混合液加入薄壁離心管中,置入PCR儀,反應(yīng)條件為42℃,60 min,后95℃,10 min,得到 cDNA。

1.4.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) PCR反應(yīng)體系為:D.W26 μ l;10 ×PCRbuffer 5 μ l;25 mMMgCl 3 μ l;2.5 mMdNTPs 4 μ l;引 物正義鏈 1 μ l;引 物反義鏈 1 μ l;cDNA 10 μ l;引物濃度為 30 pmol/μ l a)目的基因的擴(kuò)增:上述反應(yīng)液先94℃,5 min,之后加入Taq plus-DNA聚合酶0.5 μ l/每管,用TH引物進(jìn)行PCR,循環(huán)30個周期。b)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)β-肌動蛋白(β-actin)的擴(kuò)增:上述反應(yīng)液先94℃,5 min,之后加入Taq plusDNA聚合酶0.5 μ l/每管 ,用 β-actin 的引物進(jìn)行 PCR,循環(huán)30個周期。TH的PCR反應(yīng)條件為:94℃,30 S,63℃,1 min,72℃,2 min。

1.4.4 PCR產(chǎn)物定量 10 μ l PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后,溴化乙錠(EB)染色,紫外燈下觀察結(jié)果,拍照。通過圖像分析將TH與β-actin輝度比值進(jìn)行相對定量。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,方差齊性檢驗(yàn),兩均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳實(shí)時熒光定量PCR法檢測不同組TH的相對表達(dá)量見圖1、圖2?？梢娫炷：笕毖笫骉H熒光定量在6 h、24 h、3 d、7 d均明顯缺失,與正常對照組相比差異有顯著性(P＜0.01)。治療組經(jīng)電針治療后尤其在7 d時TH熒光定量接近正常,與實(shí)驗(yàn)組相比差異有顯著性(P＜0.01)。

3 討論

圖1 熒光定量PCR法檢測不同組TH的相對表達(dá)量

腦可塑性是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要特性,即在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上的可修飾性,可理解為中樞神經(jīng)系統(tǒng)因適應(yīng)機(jī)體內(nèi)外環(huán)境變化而發(fā)生的結(jié)構(gòu)與功能的變化。腦的可塑性是指在人的一生中,腦能夠改變其組織與功能的特性,它是腦組織的基本特征[5]。腦的可塑性[6]在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為:①受損神經(jīng)細(xì)胞軸突的側(cè)枝芽生,增加在部分傳入靶區(qū)的投射密度。②新長出的側(cè)枝與靶細(xì)胞再建突觸聯(lián)系,可表現(xiàn)為部分傳入靶區(qū)內(nèi)突觸性終末的數(shù)量先減少,后增加;或終末增大或每個終末上的突觸增多,或電活性增強(qiáng)等。③靶區(qū)內(nèi)部分傳入的二級神經(jīng)出現(xiàn)興奮性遞質(zhì)受體上調(diào),突觸后致密區(qū)擴(kuò)大。④膠質(zhì)細(xì)胞增多,增大等。近期的研究揭示腦缺血后的超早期(1-6小時)在腦梗死周邊區(qū)即可出現(xiàn)神經(jīng)元高興奮性和其感受域的擴(kuò)大等可塑性改變[7]?，F(xiàn)已證實(shí)腦損傷后皮質(zhì)功能發(fā)生重組,各層樹突數(shù)量呈時間依賴性增加,并且每一個神經(jīng)元的突觸數(shù)量也明顯增加[6,8]。腦的發(fā)展是基因以及從環(huán)境中輸入的刺激等多個方面動態(tài)地相互作用的過程。在這個復(fù)雜的動態(tài)系統(tǒng)中 ,有機(jī)體逐漸適應(yīng)偶然的輸入,滿足學(xué)習(xí)環(huán)境的需要,這一適應(yīng)的過程即可塑性過程[9]。海馬也是大腦具有可塑性和極易受損的一個腦區(qū),對缺血缺氧極為敏感。已有證據(jù)表明,海馬結(jié)構(gòu)是參與學(xué)習(xí)和記憶力。

圖2 熒光定量PCR法檢測不同組TH的相對表達(dá)量

TH已知是哺乳動物體內(nèi)兒茶酚胺(Catecholamine,CA)類(包括L-多巴胺,腎上腺素和去甲腎上腺素等)生物合成途徑的限速酶。在CA的合成中起催化限速的作用,現(xiàn)已有充分的證據(jù)證明TH是全部CA代謝的限速環(huán)節(jié),并在第一步驟上調(diào)控整個代謝過程[10]。已知黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元及其分泌神經(jīng)遞質(zhì),多巴胺在參與運(yùn)動的調(diào)節(jié)方面起著重要作用。由此可知,TH在調(diào)節(jié)運(yùn)動神經(jīng)元的功能方面上發(fā)揮且重要的作用。TH在調(diào)節(jié)神經(jīng)核團(tuán)的運(yùn)動性神經(jīng)纖維傳入,傳出通路中有可能同樣發(fā)揮著重要作用。TH以酪氨酸為底物,相對含量較少,活性低,Km 值約為 50 μ mol?L-1,此酶專一性強(qiáng)(專一性作用于L-酪氨酸)活性較低,在神經(jīng)元胞漿中的含量較少,因此成為兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)合成過程中的限速因子。在兒茶酚胺類遞質(zhì)生物合成的調(diào)節(jié)上,無論是突觸水平上的短周期調(diào)節(jié),還是神經(jīng)元胞體水平上的長周期調(diào)節(jié)都要通過對TH的作用來達(dá)到。因此對此酶活性的測定,有助于了解各種因子對兒茶酚胺合成的影響。老年人學(xué)習(xí)記憶功能減退、老年癡呆、帕金森氏病、衰老等都與兒茶酚胺類遞質(zhì)有關(guān)。多巴胺(Dapamine,DA)能神經(jīng)元是腦內(nèi)分化最早,且表達(dá)遞質(zhì)以及發(fā)出軸突到靶區(qū)的神經(jīng)元之一。腦內(nèi)多巴胺的作用是多方面的,它可能和軀體運(yùn)動功能、垂體內(nèi)分泌機(jī)能的加強(qiáng)以及精神活動的調(diào)節(jié)都有關(guān)系。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),TH主要分布在多巴胺能神經(jīng)元和去甲腎上腺素能神經(jīng)元,因此,TH成為這些神經(jīng)元的標(biāo)記物。TH活性下降,DA生成減少,DA能神經(jīng)元細(xì)胞變性,凋亡增加,并增加細(xì)胞對外源毒物的敏感性,更加重了腦組織的損害。

本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技術(shù)觀察各組大鼠TH的動態(tài)變化。PCR是分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室中的首選方法之一,具有簡便、安全、快速、靈敏、特異性強(qiáng)等特點(diǎn),近年來廣泛應(yīng)用于動物的微生物檢測[10]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)造模后大鼠TH因子缺血熒光定量明顯缺失,與正常對照組相比差異有顯著性(P＜0.01)。治療組經(jīng)電針治療后7d TH熒光定量接近正常,與實(shí)驗(yàn)組相比差異有顯著性(P＜0.01)。說明電針治療可促進(jìn)TH的表達(dá),但其機(jī)制尚不十分清楚?？赡芘c針刺糾正海馬神經(jīng)細(xì)胞缺血、缺氧狀態(tài)、清除自由基、減少細(xì)胞的變性有關(guān)。TH表達(dá)陽性的可能預(yù)示突觸效率和新突觸生成等結(jié)構(gòu)和功能具有可塑性改變。而針刺可增強(qiáng)突觸可塑性變化。

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Influence of electracupuncture on expression of tyrosine hydroxylase after focal cerebral ischemia in rats brain

TIAN Mingxiu,CHEN Jia-jun,ZHAO Jing,et al.(Dapartmet of Neurology,First Hospital,Jinlin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo probe the influence of electroacupuncte on expression of tyrosine hydroxylase after the focal cerebral ischemia in rat brain to find the effective mechanism of possibility.MethodsWistar rats were randomly divided into three groups:normal group;sham group and modelgroup(electroacupuncteure group).The technique of reverse transcription polymerase chain reaction is used to observe the dynamic changes of tyrosine hydroxylase.ResultsElectroacupunc ture could increase the tyrosine hydroxylase positive remarks in ischemia brain.ConclusionElectroacupuncture could protect brain against ischemic damage.Acupuncture treatrnent may be one of mechanisms of biain ischemia,suggesting that acupuncture can enhance brain plastcity.

Electroacupuncture;Cerebral ischemia;Tyrosine hydroxylase;RT-PCR

R741.02

A

1007-4287(2010)01-0034-04

*通訊作者,E-mail:Chenjiajun999@sina.com

田明秀(1971-),女,主治醫(yī)師,在讀醫(yī)學(xué)博士。主要從事腦血管以及神經(jīng)變性疾病的研究。

2008-12-24)