李金龍,耿 力,韓 剛,賈明庫(kù)

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院普通外科,吉林長(zhǎng)春 130041)

CpG ODN誘導(dǎo)人PBMC增殖的體外實(shí)驗(yàn)研究

李金龍,耿 力,韓 剛,賈明庫(kù)*

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院普通外科,吉林長(zhǎng)春 130041)

目的研究CpG ODN在體外刺激人PBMC的增殖情況。方法分別以腫瘤抗原(Ag)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)和CpG ODN單獨(dú)或聯(lián)合刺激正常人和腫瘤患者PBMC,并對(duì)其增殖活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果以CpG ODN刺激人PBMC組的細(xì)胞增殖活性明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。結(jié)論CpG ODN、IL-2與腫瘤抗原共同刺激能有效提高人PBMC的增殖活性。

CpG ODN;人外周血單核細(xì)胞

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0037)

近年來(lái)腫瘤的生物治療研究較多,并取得了一定的療效與進(jìn)步。CpG ODN具有激活宿主免疫系統(tǒng)的能力,可刺激機(jī)體活化對(duì)腫瘤的先天免疫并增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫,在疫苗佐劑的設(shè)計(jì)以及抗腫瘤免疫治療中顯示出良好的應(yīng)用前景[1]。本文通過(guò)觀察CpG ODN與IL-2、腫瘤凍融抗原共同刺激人PBMC在體外的增殖情況,為進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)腫瘤免疫治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例選擇 分別選取本院健康志愿者和結(jié)腸癌患者各5人進(jìn)行采血20 ml,并在2 h內(nèi)分離。

1.1.2 腫瘤細(xì)胞株、CpG2006和IL-2 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW1116購(gòu)自吉林省腫瘤研究所;CpG 2006由上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司合成;IL-2購(gòu)自長(zhǎng)生基因藥業(yè)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人PBMC的分離 每份血樣中加入等量生理鹽水混勻稀釋,離心。分離出離心分層后單個(gè)核細(xì)胞層,另加RPMI1640后離心,洗滌2次。計(jì)算活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)＞95%。

1.2.2 腫瘤抗原的制備 SW111細(xì)胞培養(yǎng)、傳代。細(xì)胞呈指數(shù)期生長(zhǎng)時(shí),調(diào)細(xì)胞濃度1×107/ml,共計(jì)8.8 ml。放入液氮中10 min,室溫融化,反復(fù)5次。4℃離心,收上清。同時(shí)將細(xì)胞沉淀溶于8.8 ml生理鹽水中,超聲細(xì)胞破碎儀破碎、離心,收上清。兩次離心收獲的上清混合,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PBMC的增殖培養(yǎng) 抗原3倍稀釋使之濃度與外周血細(xì)胞數(shù)之比為1∶10,將CpG ODN與IL-2濃度分別調(diào)至100 μ g/ml和 1 000 U/ml。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 (1)PBMC;(2)PBMC+Ag+IL-2;(3)PBMC+Ag+IL-2+CpG-ODN。

1.2.5 調(diào)PBMC細(xì)胞濃度為6×106/ml,接種于96孔板,每孔 50 μ l,每組 4復(fù)孔。其中PHA 10倍稀釋,每孔加 20 μ l?？乖?、CpG-ODN 和 IL-2 均每孔加20 μ l。各組分別補(bǔ)加相應(yīng)體積的IMDM 培養(yǎng)液至200 μ l/孔 。37℃、5%CO2培養(yǎng)72 h,收上清 ,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)定分兩組進(jìn)行,分別測(cè)定CpGODN刺激PBMC3天、6天后PBMC增殖情況。在培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)加入MTT(5 mg/ml)20 μ l/孔。培養(yǎng)結(jié)束離心,棄上清,各孔加入 150 μ l DMSO混勻,酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)測(cè)A值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS11.0軟件做方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

無(wú)論是在正常人組還是在腫瘤組,CpG組PBMC細(xì)胞增殖活性均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。而腫瘤組與正常人組相比較,其PBMC增殖活性則無(wú)顯著性差異(表1、2)。

表1 CpG-ODN刺激PBMC增殖活性測(cè)定(正常人組,±s,n=4)

表1 CpG-ODN刺激PBMC增殖活性測(cè)定(正常人組,±s,n=4)

與PBMC空白對(duì)照組相比,*P＜0.05;與不加CpG的相應(yīng)對(duì)照組相比,△P＜0.05

組別A 值(±s)培養(yǎng)3天 培養(yǎng)6天PBMC 0.231±0.006 0.383±0.066 PBMC+Ag+IL-2 0.298±0.003* 0.457±0.031 PBMC+CpG+Ag+IL-2 0.423±0.006*△ 0.691±0.005*△

3 討論

過(guò)繼免疫治療是近年來(lái)腫瘤治療的新方法之一,其基本原理是通過(guò)輸注自體或同種異體特異性或非特異性腫瘤殺傷細(xì)胞(主要為免疫活性細(xì)胞)而達(dá)到治療腫瘤的目的。1985年美國(guó)學(xué)者Rosenberg等創(chuàng)立IL-2+LAK細(xì)胞療法后,這種療法得到廣泛的重視,現(xiàn)已形成了先在體外激活和擴(kuò)增殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞,然后再回輸病人的這種程序[2]。腫瘤特異性CTL細(xì)胞取自患者自身的外周血淋巴細(xì)胞,在有腫瘤抗原及IL-2存在的條件下,在體外進(jìn)行二次致敏和擴(kuò)增。這種細(xì)胞特異性高,殺傷力強(qiáng)。但由于治療腫瘤時(shí)要求效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例保持在100-10/1,治療一次需要細(xì)胞較多,應(yīng)用上受到一定的限制。

表2 CpG-ODN刺激PBMC增殖活性測(cè)定(腫瘤組,±s,n=4)

與PBMC空白對(duì)照組相比,*P＜0.05;與不加CpG的相應(yīng)對(duì)照組相比,△P＜0.05

本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的CpG2006為B型CpGODN,是由三磷酸核苷酸和多個(gè)未甲基化的CpG二核苷酸共同構(gòu)成PTO骨架,并由PolyT間隔4個(gè)TCGT基序組成的24 bp的寡核苷酸片斷,為全硫代硫酸二酯鍵修飾,具有抵抗細(xì)胞內(nèi)核酶降解作用的全程留待修飾的PS骨架(核苷酸的磷酸二酯鍵的游離氧原子被硫代修飾),這種骨架有力于加強(qiáng)對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激作用。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用全硫代的CpG 2006與IL-2、腫瘤凍融抗原共同刺激能有效的提高正常人和腫瘤病人的PBMC的增殖活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)CpG2006能有效地促進(jìn)外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖,國(guó)外文獻(xiàn)亦有相同報(bào)導(dǎo)[3]。

[1]WeinerGJ,Liu H M,Wooldridge JE,et al.Immunostimulatory oligodeoxynucleotides containing the CpG motif are effective as immune adjuvants in tumor antigen immunization[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94:10833.

[2]Rosenberg SA,Lotze MT,Yang JC,et al.Experience with the use of highdose interleukin-2 in the treatment of 652 cancer patients[J].Ann Surg,1989,210:474.

[3]Gursel M,Verthelyi D,Klinman DM.CpG oligodeoxynucleotides induce human monocytes to mature into functional dendritic cells[J].Eur J Immunol,2002,32:2617.

The proliferation of human PBMC induced by CpG ODN in vitro

LI Jin-long,GENGLi,HAN Gang,et al.(The Second Hospital of Jilin University,Changchun130041,China)

ObjectiveStudy the proliferation of human PBMC stimulated by CpG ODN in vitro.MethodsStimulate PBMCs of health adults and patientssuffered from cancer with tumor antigen,IL-2 or CpG ODN and determine their proliferative activity.ResultsThe cell proliferation activity of CpG ODN stimulating group is higher than the other groups(P＜0.05).ConclusionThe proliferative activity of human PBMC can be improved effectively with the stimulations of CpG ODN,IL-2 and tumor antigen together.

CpG ODN;PBMC;Proliferation

R730.54

A

1007-4287(2010)01-0037-02

吉林省科技廳資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)20050410-5)

*通訊作者

2008-12-24)