宋澤慶,陳 敏,陳莉延

(廣東醫(yī)學(xué)院呼吸疾病研究所,廣東湛江 524001)

廣東籍漢族患者CD14基因-159C/T位點(diǎn)多態(tài)性分析

宋澤慶,陳 敏,陳莉延

(廣東醫(yī)學(xué)院呼吸疾病研究所,廣東湛江 524001)

目的探討廣東籍漢族人CD14基因-159C/T位點(diǎn)多態(tài)性和哮喘易感性及對(duì)血漿IgE水平的影響。方法正常組和哮喘組各100例。取外周血離心后,用ELISA法測(cè)定血漿IgE水平,抽提DNA,用RFLP-PCR方法檢測(cè)CD14基因-159C/T位點(diǎn)多態(tài)性分布。結(jié)果對(duì)照組和哮喘組等位基因C、T分布差異有顯著性(χ2=7.61,P＜0.01),C等位基因和哮喘相關(guān)(OR(C/T)=1.77,95%CI=1.178-2.643,P＜0.01)兩組基因型(TT、CT、CC)頻率的分布差異亦有顯著意義(χ 2=7.651,P＜0.01),同組內(nèi),C等位基因攜帶者血漿IgE水平高于非攜帶者;同一基因型,哮喘組IgE水平高于對(duì)照組。結(jié)論CD14基因啟動(dòng)子-159位點(diǎn)多態(tài)性和哮喘易感性有關(guān),C等位基因和血漿IgE水平升高相關(guān)聯(lián)。

哮喘;CD14;多態(tài)性;IgE

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0056)

哮喘是一種變應(yīng)性疾病,是由環(huán)境和遺傳因素共同作用引起。遺傳易感性在哮喘的發(fā)病中起重要作用,對(duì)哮喘進(jìn)行遺傳學(xué)研究是探討其發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要方面。本研究通過(guò)對(duì)哮喘組和對(duì)照組CD14基因-159位點(diǎn)多態(tài)性及血漿總IgE水平的檢測(cè),探討CD14基因-159位點(diǎn)多態(tài)性在哮喘發(fā)病中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

哮喘組:隨機(jī)選擇廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診和住院支氣管哮喘患者100例,全部病例均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸分會(huì)2003年制定的《支氣管哮喘防治指南》標(biāo)準(zhǔn)[1]。年齡 14-71歲,男 55例,女 45例;對(duì)照組:隨機(jī)選擇廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診、保健科健康體檢人員100人,男53,女47例,年齡17-68歲。經(jīng)檢驗(yàn),兩組人群年齡、性別無(wú)顯著性差異。上述全部研究對(duì)象均為無(wú)血緣關(guān)系的廣東籍漢族人。對(duì)照組均無(wú)哮喘病史,無(wú)家庭及個(gè)人過(guò)敏史。

1.2 標(biāo)本收集及基因組DNA抽提 抽取空腹外周血2 ml,EDTA抗凝,離心后留取血漿約100 μ l,-70℃凍存。余下部分用低滲溶解紅細(xì)胞快速抽提法[2](稍作改良)從白細(xì)胞中抽提基因組DNA。

1.3 聚合酶鏈反應(yīng) 引物序列參考文獻(xiàn)[3]:所需引物5-GTGCCAACAGATGAGG TTCAC-3,5-GCCTCTGACAGTTTATGTAATC-3。PCR反應(yīng)在 PCR儀上進(jìn)行,總反應(yīng)體積為50 μ l,80 ng基因組DNA,10mmol/L Tris-HCl(pH8.3),50 mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2,200 μ mol/L dNTP,上下游引物各50 ng,1.5 U Taq DNA聚合酶。反應(yīng)過(guò)程:96℃起始變性3分鐘,96℃40秒,56℃40秒,72℃50秒,最后72℃延伸2分鐘,共38個(gè)循環(huán)。

1.4 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè) 取PCR產(chǎn)物10 μ l加AvaⅡ6 U,37℃酶切過(guò)夜,然后在2%瓊脂糖凝膠,取6 μ l酶切產(chǎn)物在凝膠上上樣電泳,EB染色后紫外燈照射下觀察成像。-159位點(diǎn)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為497 bp,基因型TT存在AvaⅡ酶切位點(diǎn),酶切產(chǎn)物為144 bp、353 bp,TT基因型無(wú)此酶切位點(diǎn)。而CT基因型酶切產(chǎn)物則為497 bp、144 bp及353 bp。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA) 用ELISA方法檢測(cè)血漿IgE,嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用基因計(jì)數(shù)方法計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)基因型、等位基因頻率,其比較及基因型Hardy-Weinburg平衡吻合度用χ2檢驗(yàn);用單因素方差分析(One-way ANOVY)比較正常組和哮喘組血漿IgE水平的差別;不同基因型血漿IgE水平的兩兩比較用q檢驗(yàn);同基因型不同組血漿IgE水平的兩兩比較用t檢驗(yàn)。以上統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SAS 8.2軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 RFLP-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1

2.2 哮喘與對(duì)照組-159位點(diǎn)基因型頻率分布經(jīng)Hardy-Weinburg平衡吻合度檢驗(yàn)達(dá)到遺傳平衡(表1)。該位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率比較見(jiàn)表2。

圖1 -159位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切后電泳結(jié)果

表1 -159位點(diǎn)基因型分布的 Hardy-Weinburg平衡

3 討論

CD14基因位于5q13.1其表達(dá)的產(chǎn)物是CD14分子,它是一種LPS受體[4],和LPS有較高的親和力。很早人們便發(fā)現(xiàn)該基因和變應(yīng)性及血漿IgE水平相關(guān)聯(lián)。Baldini等首先報(bào)道了CD14啟動(dòng)子-159位點(diǎn)的CT多態(tài)性和變應(yīng)性有關(guān),他發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)TT純合子sCD14的水平高于CT雜合子和TT純合子,而IgE水平確低于后兩者[3]。香港進(jìn)行的一項(xiàng)對(duì)中國(guó)兒童的調(diào)查發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)CC純合子和IgE升高是相關(guān)的[5]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn),哮喘組和正常組間其基因型的分布差異有顯著性 χ2=7.651,P＜0.01。在哮喘組和對(duì)照組中其攜帶的C等位基因是有差異的,前者高于后者,研究證實(shí)了C等位基因和哮喘有關(guān),C等位基因攜帶者哮喘的危險(xiǎn)性高于T等位基因攜帶者OR(C/T)=1.77。

表2 -159位點(diǎn)對(duì)照與哮喘組等位基因頻率及基因型頻率比較

表3 -159位點(diǎn)對(duì)照與哮喘組不同基因型血漿IgE水平的比較

哮喘是變應(yīng)性炎癥,IgE升高是其一個(gè)特征。本研究發(fā)現(xiàn)在哮喘組中各等位基因型的分布符合Hardy-Weinburg平衡。無(wú)論是哮喘組和對(duì)照組不同基因型之間其血漿IgE水平差異有顯著性。CC基因型者其血漿IgE明顯高于CT和TT,C等位基因攜帶者有更高的IgE水平,這和以前的研究相同。研究發(fā)現(xiàn)CD14啟動(dòng)子多態(tài)性使機(jī)體出于一種高變應(yīng)狀態(tài),即機(jī)體的遺傳素質(zhì)決定了這一規(guī)律,雖然從T等位基因到C等位基因的突變使IgE水平升高,但目前尚無(wú)資料表明C等位基因和哮喘發(fā)病嚴(yán)重程度相關(guān)。Koppelman的研究證實(shí)C等位基因直接影響變應(yīng)性的表達(dá)和變應(yīng)的嚴(yán)重程度,即更高的皮膚試驗(yàn)陽(yáng)性率和IgE水平[6]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)CD14啟動(dòng)子多態(tài)性能下調(diào)CD14的表達(dá)水平,而研究表明CD14和IgE水平呈負(fù)相關(guān)[7]。CD14能和細(xì)菌細(xì)胞壁LPS相結(jié)合,導(dǎo)致Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化,這種效應(yīng)可因CD14在濃度的升高而減弱,但具體機(jī)制尚未明了[8]。我們推測(cè)啟動(dòng)子該位點(diǎn)T到C的突變很可能改變了啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率,使轉(zhuǎn)錄增加,CD14濃度升高,Th1/Th2平衡向Th2傾斜,炎癥因子IL-13,IL-4,IL-5增多,IgE產(chǎn)生增多,最終導(dǎo)致哮喘易感性的出現(xiàn)。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組.支氣管哮喘防治指南[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2003,26:132.

[2]Lahiri D K,Schnabel B.DNA isolation by a rapid method from human blood samples:effects of MgCl2,EDTA,storage time,and temperature on DNA yield and quality[J].Biochem Genet,1993,31:321

[3]Baldini M,Lohman IC,Halonen M,A Polymorphism*in the 5'flanking region of the CD14 gene is associated with circulating soluble CD14 levels and with total serum immunoglobulin E[J].Am J Respir Cell Mol Biol,1999,20(5):976.

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[7]Vercelli D,Baldini M,Martinez F.The monocyte/IgE connection:may polymorphisms in the CD14 gene teach us about IgE regulation[J].Int Arch Allergy Immunol,2001,124:20.

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Association of CD14 gene-159C/T polymorphism with asthma in the chinese Han population from Guangdong province

SONGZe-qing,CHEN Min,CHEN Li-yan.(Institute of Respiratory Diseases,Guangdong MedicalCollege,Zhanjiang524001,China)

ObjectiveTo investigate the correlation between the polymorphism at-159 locus in CD14 gene and asthma and its impact upon plasm IgE level.Methods100 asthma subjects and 100 control subjects were chosen.DNA was isolated from the blood.Polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism(PCR/R FLP)techniques were used to determine-159 locus polymorphism,and plasm IgE level were tested by ELISA.ResultsThe distribution of C andT allelesof-159 are significantly different between the two group,(χ2=7.61,＜0.01),C allele is associated with asthma.(OR(C/T)=1.77,95%CI=1.178-2.643,P＜0.01)The genetype(CC,CT andTT)distributionwasalso significantly different betweentwo groups(χ 2=7.651,P＜0.01);in each group,subjectswith C allele has higherIgE level than subjectswithout C allele,asthma group hashigher IgE level than controlgroupwith same genetype.ConclusionThe-159 polymorphism of CD14 gene may be associatedwith asthma.C allele is associated with higher IgE level.

asthma;CD14;polymorphism;IgE

R562.2+5

A

1007-4287(2010)01-0056-03

2009-03-18)