吳 藝,郭小東,劉 潔

(1.廣東省第二人民醫(yī)院眼科,廣東廣州 510317;2.中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)視神經(jīng)損傷大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響

吳 藝1,郭小東1,劉 潔2

(1.廣東省第二人民醫(yī)院眼科,廣東廣州 510317;2.中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心)

目的研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)視神經(jīng)損傷大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的作用。方法制作大鼠視神經(jīng)鉗夾傷模型,隨機(jī)分為干細(xì)胞移植治療組(M組)和磷酸緩沖液治療對(duì)照組(P組),取大鼠股骨和脛骨骨髓,密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法分離純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)并鑒定,將傳代培養(yǎng)后的定量MSCs注入損傷術(shù)后M組大鼠雙眼玻璃體內(nèi),P組大鼠則注入等體積PBS,觀察視神經(jīng)損傷后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d和 28 d視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)改變并應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率變化。結(jié)果視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell,R GCs)數(shù)目隨時(shí)間延長而減少,組內(nèi)前后時(shí)間段比較有顯著性差異(P＜0.05);M組RGCs降低速度明顯慢于P組,M組各時(shí)間段RGCs數(shù)目與P組同時(shí)間段相比均增高,有顯著性差異(P＜0.05);視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜細(xì)胞出現(xiàn)凋亡,1 d-14 d內(nèi)隨時(shí)間延長凋亡率不斷上升,14 d達(dá)到高峰,隨后下降;損傷后21 d內(nèi)M組各時(shí)間段細(xì)胞凋亡率均低于P組,二者比較有顯著性差異(P＜0.05),損傷后28 d二者的細(xì)胞凋亡率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)論MSCs玻璃體內(nèi)移植可提高視神經(jīng)損傷大鼠RGCs的存活率,抵抗視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡。

視 神經(jīng) 損傷;骨 髓間充 質(zhì)干 細(xì)胞;視 網(wǎng)膜 神經(jīng)節(jié) 細(xì)胞 ;細(xì)胞 凋亡

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0987)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療作用在不同實(shí)驗(yàn)研究中得到證實(shí)[1,2],也有研究將自體MSCs移植到玻璃體內(nèi)或視網(wǎng)膜下腔,發(fā)現(xiàn)移植的MSCs能與宿主視網(wǎng)膜整合,并分化表達(dá)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞特異性抗原[3,4]。但其在視神經(jīng)損傷治療中的研究尚未見報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)將體外培養(yǎng)后的定量MSCs注入視神經(jīng)損傷大鼠雙眼玻璃體內(nèi),觀察在不同時(shí)間段RGCs的變化及視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況,以探討MSCs移植對(duì)視神經(jīng)損傷的修復(fù)作用和機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

L-DMEM(GIBCO/BRI)、胎牛血清(Hyclone公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、淋巴細(xì)胞分離液(上海恒信化學(xué)試劑有限公司)、兔抗大鼠CD44、CD45多克隆抗體、山羊抗兔SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自博士德公司;碘化丙啶(PI)購于上海華美生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng) 出生8-14 d的健康SD大鼠,體重15-20 g,雌雄不限,由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。實(shí)驗(yàn)無菌條件下取SD大鼠脛骨和股骨,切除干骺端,用含10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 mg/ml鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,收集沖洗液反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液。取一無菌離心管,加入和骨髓懸液等體積的大鼠淋巴細(xì)胞分離液,室溫靜止15 min,將細(xì)胞懸液緩慢滴加到淋巴細(xì)胞分離液上層,4℃,2 000 rpm離心25 min,吸取單核細(xì)胞密度界面層細(xì)胞,加無血清培養(yǎng)液稀釋至5 ml,1 000 rpm離心5 min洗滌2次,以含20%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液重懸沉淀后計(jì)數(shù)細(xì)胞按2×106/ml密度接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶,放入37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。第 3 d半量換液,除掉不貼壁的血細(xì)胞和造血干細(xì)胞,以后每3d換液一次,在倒置顯微鏡下觀察,待10-14 d細(xì)胞接近80-90%匯和時(shí),0.125%胰蛋白酶消化,傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MSCs鑒定 胰酶消化傳代的MSCs制成1×104/ml單細(xì)胞懸液,接種于預(yù)先放置多聚賴氨酸包被蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi),常規(guī)培養(yǎng)48 h,棄去培養(yǎng)液,0.1 M冷PBS沖洗,冷丙酮固定15 min,3%過氧化氫封閉10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶,正常山羊血清封閉20 min,加1∶100稀釋的一抗(兔抗大鼠CD44、CD45)37℃孵育1 h,滴加生物素化山羊抗兔二抗 37℃孵育30 min,滴加SABC試劑37℃孵育20 min,DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透明、封片,顯微鏡下觀察拍照,同時(shí)用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.3 模型制作及分組 成年SD大鼠66只,體量250-350 g,由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供,外眼及眼底檢查均正常。60只按隨機(jī)數(shù)字表法分為干細(xì)胞移植治療組(M組)和磷酸緩沖液治療對(duì)照(P組),每組30只,參照文獻(xiàn)建立視神經(jīng)部分損傷模型:40 mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉后,充分暴露視神經(jīng),用反向鑷于球后2 mm處夾持雙側(cè)視神經(jīng)30 s,夾持后無持續(xù)缺血,段時(shí)間血流恢復(fù)良好者證明模型成功,操作中避免損傷血管。M組在損傷術(shù)后立即向雙眼玻璃體內(nèi)注入定量MSCs,P組則注入等體積0.1MPBS,分別于治療后 1 d、3 d 、7 d、14 d 、21 d、28 d處死大鼠(每個(gè)時(shí)間段5只)。另取6只大鼠假手術(shù)組作為對(duì)照,在同一時(shí)間點(diǎn)取一只處死,標(biāo)本的處理同治療組。

1.2.4 細(xì)胞移植 取3代MSCs細(xì)胞,胰酶消化,用0.1MPBS制成 2×104個(gè)/μ l細(xì)胞懸液,置于冰上。40 mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉大鼠,M組用微玻管從眼球鞏膜角膜緣處緩慢注入1.5 μ l MSCs懸液,P組則注射等量 PBS,分別于移植實(shí)驗(yàn)后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d處死動(dòng)物,摘除眼球,HE染色后光鏡下觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化、顯微圖像分析計(jì)數(shù)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,流式細(xì)胞儀測(cè)定視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)觀察和RGCs計(jì)數(shù) 新鮮眼球,常規(guī)酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,縱向視網(wǎng)膜全層切片,厚5 μ m,HE染色,中性樹脂封片,光鏡下觀察。每只眼球以視網(wǎng)膜中心層切片為基準(zhǔn),再從其前后相鄰部位各取一張切片,共計(jì)3張切片,每張任意選取5個(gè)高倍視野(×40),采用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量RGCs數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 在墊有冰塊的玻璃平皿中小心去除角膜和晶狀體,剝離下視網(wǎng)膜,D-Hanks液漂洗2次,置于 4℃預(yù)冷的生理鹽水中備用。剪碎研磨視網(wǎng)膜,加入0.25%胰蛋白酶和0.5%膠原酶(1∶1)37℃振蕩消化10 min,移液管吹打,鏡下觀察直至分散成單個(gè)細(xì)胞,用10%胎牛血清終止反應(yīng)。4℃1 000 rpm離心5 min,棄上清,PBS洗滌后離心收集細(xì)胞,70%冰預(yù)冷乙醇4℃固定24 h,離心棄去固定液,PBS洗滌后重懸沉淀,加入 50 μ g/ml RNase 37℃反應(yīng)1 h,400目篩網(wǎng)過濾,1 000 rpm離心5 min,棄去 PBS,100 μ g/ml PI 4℃避光染色 30 min。

2 結(jié)果

2.1 MSCs純化和鑒定

經(jīng)分離純化的細(xì)胞體外培養(yǎng)48 h后,多數(shù)呈球形、橢圓形貼壁生長;72 h后大多數(shù)細(xì)胞呈梭形并帶有多個(gè)突起,細(xì)胞核較大,扁圓形,可見1-2個(gè)核仁;培養(yǎng)10-12 d,細(xì)胞形態(tài)較為均一,胞體細(xì)長呈梭形;反復(fù)換液和傳代培養(yǎng)去除非貼壁細(xì)胞,至第3代時(shí)細(xì)胞呈梭形或扁平形,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞融合呈漩渦狀排列。CD44、CD45免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽性反應(yīng),表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色顆粒,陰性對(duì)照組胞質(zhì)不著色。

2.2 視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)改變

正常對(duì)照組視網(wǎng)膜由內(nèi)向外分為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層和外核層,各層平行致密排列;視神經(jīng)損傷后1 d、3 d僅見視網(wǎng)膜毛細(xì)血管不同程度擴(kuò)張,少數(shù)破裂出血,各治療組同正常對(duì)照組相比無明顯改變;傷后7 d,P組可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層胞核散亂分布,體積縮小,核染色質(zhì)邊聚濃集,內(nèi)核層及外核層變薄,細(xì)胞排列紊亂,M組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)無明顯變化;14 d,P組胞核數(shù)目明顯減少,稀疏排列,濃縮核多見,內(nèi)核層及外核層明顯變薄,M組大而淺染的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核減少,染色質(zhì)濃集明顯;21 d,28 d,P組和M組各層細(xì)胞數(shù)目明顯減少,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層胞核稀少,染色質(zhì)濃集,空化節(jié)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞浸潤,內(nèi)、外核層細(xì)胞減少,M組損傷程度相對(duì)較輕。

2.3 RGCs計(jì)數(shù)

視神經(jīng)損傷后1 d,M組和P組 RGCs稍有下降,與正常對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05);3 d時(shí)M組和P組細(xì)胞數(shù)目開始明顯減少,7 d之前細(xì)胞數(shù)目迅速下降,14 d后速度減慢,21 d后細(xì)胞數(shù)目無明顯減少,M組各時(shí)間點(diǎn)RGCs數(shù)均高于P組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但均低于對(duì)照組;對(duì)照組RGCs數(shù)量在各時(shí)間點(diǎn)沒有明顯變化。各時(shí)間點(diǎn)具體的數(shù)目改變見表1。

表1 視神經(jīng)損傷不同時(shí)間組RGCs數(shù)目改變

2.4 細(xì)胞凋亡率

對(duì)照組沒有檢測(cè)到典型的細(xì)胞凋亡峰,損傷后1 d、3 d、7 d和14 d細(xì)胞凋亡率逐漸增多,至第14 d達(dá)高峰,21 d細(xì)胞凋亡率下降,28 d持續(xù)減少。在損傷28 d時(shí)M組和P組細(xì)胞凋亡率差異不顯著(P＞0.05),其余各時(shí)間點(diǎn)M組細(xì)胞凋亡率均低于P組,二者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),各時(shí)間點(diǎn)具體細(xì)胞凋亡率改變見表2。

表2 視神經(jīng)損傷不同時(shí)間組細(xì)胞凋亡率改變

3 討論

由于視神經(jīng)損傷晚期,RGCs已大部分或全部發(fā)生凋亡,殘留細(xì)胞數(shù)目非常有限,即使這些細(xì)胞的軸突完全再生,也不足恢復(fù)有效的神經(jīng)功能,無法達(dá)到治療目的。隨著分子生物學(xué)和組織工程學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,轉(zhuǎn)基因治療聯(lián)合干細(xì)胞移植技術(shù)將為臨床處理本病提供新的治療思路。神經(jīng)干細(xì)胞雖然是較為理想的有效移植物,但由于其來源僅限于胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化或從胎腦、胎眼中直接分離,很難獲得足夠的神經(jīng)細(xì)胞移植物滿足臨床需求[5];雖然可利用自體細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增后再移植,但由于中樞神經(jīng)細(xì)胞位置深在,獲取細(xì)胞必然對(duì)組織造成損傷,因此尋找一種新的移植細(xì)胞來源對(duì)于基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用都至關(guān)重要。

MSCs是目前干細(xì)胞研究中最受關(guān)注的一種細(xì)胞,其優(yōu)點(diǎn)為:①抗原性弱,無免疫排斥;②標(biāo)本來源廣泛(骨髓穿刺、臍血與外周血),容易獲得;③分離培養(yǎng)增殖速度快,能大量擴(kuò)增;④具有多種分化潛能,易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá);⑤無任何道德或法律問題[6]。MSCs移植對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療作用在不同實(shí)驗(yàn)研究中得到證實(shí),實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)MSCs移植后遍及全腦,并分化成為神經(jīng)細(xì)胞,呈現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的特征[7]。其作用機(jī)制可能是多方面:移植的MSCs向病變部位組織滲透融合、替代損傷細(xì)胞、重建神經(jīng)環(huán)路,從而達(dá)到恢復(fù)神經(jīng)功能的目的;一些移植的MSCs在新環(huán)境誘導(dǎo)下可以表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞表型;MSCs同宿主神經(jīng)組織間的相互作用還可導(dǎo)致一些細(xì)胞因子的產(chǎn)生,這些細(xì)胞因子對(duì)神經(jīng)功能的恢復(fù)發(fā)揮積極的作用[8]。

在本研究中我們將定量MSCs注入視神經(jīng)損傷術(shù)后大鼠雙眼玻璃體內(nèi),觀察不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜形態(tài),RGCs數(shù)目及視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率改變,結(jié)果顯示損傷3 d時(shí)M組和P組細(xì)胞數(shù)目開始明顯減少,7 d之前細(xì)胞數(shù)目迅速下降,14 d后速度減慢,21 d后細(xì)胞數(shù)目無明顯減少,MSCs治療后RGCs數(shù)目增加;損傷后1d、3d、7d和14d細(xì)胞凋亡率逐漸增多,至第14 d達(dá)高峰,21d細(xì)胞凋亡率下降,28d持續(xù)減少。在損傷28d時(shí)M組和P組細(xì)胞凋亡率差異不顯著,其余各時(shí)間點(diǎn)M組細(xì)胞凋亡率均低于P組,二者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于可見MSCs玻璃體內(nèi)移植可以有效緩解視神經(jīng)損傷后RGCs破壞,抑制其凋亡,提高細(xì)胞存活率,從而為MSCs對(duì)受損節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),MSCs及轉(zhuǎn)基因MSCs移植將可能成為視神經(jīng)損傷治療的新策略。目前關(guān)于RGCs凋亡的具體機(jī)制尚不十分明確,有待進(jìn)一步深入研究探討。

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The influence of mesenchymal stem cell transplantation on the cell apoptosis after optical nerve injury in rats

WUYi,Guo Xiao-dong,LIU Jie.(Ophthalmology,Department of the Second Hospital of Guangdong Province,Guangzhou510317,China)

ObjectiveTo investigate the effect of mesenchymal stem cell(MSCs)transplantation on retinal ganglion cells(RGCs)of Sprague-Dawley(SD)rats with optic nerve injury.MethodsOptic nerve crush injury modelswere induced in the eyes of sixty-six adult SD rats by a calibratedmethod,whichwere randomly divided into group M(MSCs)andgroupP(PBS).MSCswere isolated from SD rats by gradient centrifugation and anchoring culture method.Immunocytochemical staining was used to explore the surface antigen marker.The morphological changes of optic nerves were observed andthe number of R GCs were examined by HE staining at 1 d、3 d 、7 d、14 d、21 d and 28 d after optic nerve injury.At the same time,cell apoptosis rate of retinal was measured by flow cytometery.ResultsThe number of RGCs was reduced significantly after optical nerve injury.The speed of R GCs decline in M group was more slowly than that of the P group,the number of R GCs inM groupwere higher compared with the P group at the same injury period,there was statistical significance between them(P＜0.05).The rate of cell apoptosis increased and reached peak at 14d after optical nerve injury and then decreased.The apoptotic rate of M groupwere lower than that of P group at 1 d、3 d、7 d、14 d、21 d,there was statistical significance between them(P＜0.05).At 28 d after injury,there was no statistical significance betweenM group and P group(P＞0.05).ConclusionMSCs transplantation could rescue the survival rate of injured RGCs in optic nerve-crush rat and resist the cell apoptosis of retinal to realize it's protective effect.

optical nerve injury;mesenchymal stem cell;retinal ganglion cells;apoptosis

R329.2+8 R774.1

A

1007-4287(2010)07-0987-03

廣東省醫(yī)學(xué)基金資助項(xiàng)目(A2008137)

2009-06-12)