侯秋蓮,張富春,張文寶,吾拉木?馬木提,張壯志

2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830046;

3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所,烏魯木齊 830000

定量PCR研究細(xì)粒棘球蚴抗氧化相關(guān)基因的差異表達(dá)*

侯秋蓮1,張富春2,張文寶3,吾拉木?馬木提1,張壯志3

目的在已構(gòu)建的氧化脅迫下細(xì)粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)與正常組織差異表達(dá)的消減cDNA文庫(kù)中,篩選細(xì)粒棘球蚴在抗氧化過(guò)程中差異表達(dá)的重要基因。方法將前期研究中應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization,SSH)構(gòu)建氧化脅迫下細(xì)粒棘球蚴差異表達(dá)基因的消減cDNA文庫(kù)進(jìn)行藍(lán)白斑篩選和菌落PCR分析后測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果利用BLAST在線(xiàn)軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列比對(duì)分析和BlastX分析。從文庫(kù)中隨機(jī)挑選4個(gè)未知新序列和抗氧化密切相關(guān)的TPx基因片段,利用定量PCR法研究氧化脅迫下,差異表達(dá)基因片段在mRNA水平上的變化情況。結(jié)果整個(gè)文庫(kù)克隆測(cè)序結(jié)果獲得重要基因的cDNA序列,如氧化還原酶、蛋白激酶、生長(zhǎng)因子等。另有部分克隆在GenBank中無(wú)法查到對(duì)應(yīng)的同源基因,可能代表了新基因。定量PCR結(jié)果顯示:S88、H32-1兩個(gè)基因在0.8 mmol/L H2O2氧化脅迫的原頭蚴中表達(dá)量分別上調(diào)為未經(jīng)氧化脅迫原頭蚴中的2.0和2.3倍,TPx基因片段當(dāng)H2O2濃度大于0.8 mmol/L時(shí),其表達(dá)量增高。結(jié)論上述基因的上調(diào)表達(dá)很可能與細(xì)粒棘球蚴在抗氧化過(guò)程中的相關(guān)功能有密切的聯(lián)系,可以作為研究細(xì)粒棘球蚴抗氧化的候選基因。

細(xì)粒棘球蚴;氧化脅迫;抑制性消減雜交;熒光定量PCR;基因差異表達(dá)

2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830046;

3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所,烏魯木齊 830000

細(xì)粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)是囊性包蟲(chóng)病的病原體,棘球蚴以包囊形式在人和其它中間宿主的內(nèi)臟器官中生長(zhǎng),在其早期發(fā)育階段,包囊自身和宿主的新陳代謝及對(duì)感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答都會(huì)產(chǎn)生大量的不穩(wěn)定的活性氧類(lèi)物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS),ROS具有很高的反應(yīng)性,能夠?qū)Φ鞍住⒛ぶ虳NA造成直接的損傷,產(chǎn)生嚴(yán)重的生物學(xué)效應(yīng),當(dāng)在機(jī)體內(nèi)大量堆積時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞、組織的死亡〔1-2〕。1998 年,Salinas等〔3〕發(fā)現(xiàn):在體外培養(yǎng)條件下,細(xì)粒棘球蚴的幼蟲(chóng)原頭蚴(PSC)階段可以代謝H2O2,而在其體內(nèi)檢測(cè)不到過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性,因此推測(cè)細(xì)粒棘球蚴體內(nèi)存在其它的抗氧化基因,保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用,其對(duì)于棘球蚴在人和其它中間宿主內(nèi)臟器官中存活是十分必要的。

在前期研究中〔4〕,構(gòu)建了氧化脅迫下細(xì)粒棘球蚴與正常組織差異表達(dá)的消減cDNA文庫(kù),本研究應(yīng)用real-time PCR技術(shù),進(jìn)一步對(duì)細(xì)粒棘球蚴在氧化脅迫下基因的mRNA水平差異表達(dá)進(jìn)行研究,探究細(xì)粒棘球蚴在氧化誘導(dǎo)過(guò)程中相關(guān)靶基因的表達(dá)變化及其功能。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 從新疆烏魯木齊市屠宰場(chǎng)新鮮采集自然感染細(xì)粒棘球蚴的綿羊肝臟,立即帶回實(shí)驗(yàn)室,清潔臟器表面。在無(wú)菌條件下,用吸管吸取原頭蚴,將其置于含有青鏈霉素的無(wú)菌PBS液中(pH 7.3),洗3次,離心后將沉淀加入1%pepsin(pH 3.0)中,于37℃消化30 min后,用吸管反復(fù)抽吸以破壞囊膜,使原頭蚴從育囊中散出,同時(shí)用無(wú)菌PBS液漂洗3次除去育囊碎片,倒置顯微鏡下檢查其活性,用含有10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基無(wú)菌培養(yǎng)于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24 h的原頭蚴用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(High Glucose)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;T rizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清FBS 、T4DNA 連接酶 、pMD18-T 載體 、DNA Marker、X-Gal、ExTaqDNA聚合酶均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物公司;DH5α大腸桿菌為本室保存;DNaseⅠ、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagentKit(TaKaRaCode:DRR037S)、熒光定量 PCR 試劑盒 SYBR○RPremix Ex TaqTM(Perfect Real Time)(TaKaRa Code:DRR041S)購(gòu)自 TaKaRa公司;熒光定量PCR采用德國(guó) Roche公司的 Lightcycler 1.5型熒光定量PCR儀,以及該公司生產(chǎn)的Real time PCR專(zhuān)用加樣毛細(xì)管;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 消減cDNA文庫(kù)構(gòu)建 見(jiàn)文獻(xiàn)4。

1.2.2 消減cDNA文庫(kù)的鑒定、測(cè)序與序列分析各取SSH文庫(kù)中1μ L菌液作為PCR擴(kuò)增模板,以pMD18-T載體多克隆位點(diǎn)兩端通用引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增,證明含有插入片段后(200-1 000 bp),將整個(gè)文庫(kù)送天根生化科技(北京)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果去除載體和引物序列以后,利用BLAST在線(xiàn)軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列比對(duì)分析和BlastX分析。

1.2.3 差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)測(cè)序分析結(jié)果,從文庫(kù)中隨機(jī)挑選4個(gè)未知新序列和抗氧化密切相關(guān)的TPx基因片段,設(shè)計(jì)定量PCR引物(表1),以ActinⅠ基因?yàn)閰⒄諛?biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量分析。原頭蚴進(jìn)行不同H2O2濃度(0,0.8,1.6,2.4 mmol/L)的氧化脅迫處理24 h,總RNA的抽提采用 Trlzol試劑,用 RNase Free DNaseⅠ處理總RNA,以除去總RNA的DNA。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 采用TaKaRa公司的Prime-ScriptTMRT reagent Kit。反應(yīng)體系為:模板2 μ L,5×PrimeScript緩沖液4 μ L,PrimeScript酶混合物1 μ L,Oligo dT 和 Random 6 mers 引物各 1 μ L,加RNase Free dH2O至總體系為20μ L。

1.2.5 Real time PCR反應(yīng) 取相同量的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng),real-time PCR反應(yīng)采用TaKaRa公司的SYBR?Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time),按照說(shuō)明書(shū)在冰上配制PCR反應(yīng)液,每個(gè)樣品重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn) real-time PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線(xiàn)和融解曲線(xiàn)。

表1 定量RT-PCR所用的基因特異性引物Table 1 Gene specific primers for quantitative RT-PCR

1.3 定量PCR數(shù)據(jù)處理 利用實(shí)時(shí)定量PCR分析基因在不同組織中的表達(dá)差異,目前常用的是相對(duì)定量法 ,多采用 2–ΔΔCt法〔5〕,確定特定熒光域值對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)的Ct值,對(duì)目標(biāo)基因定量。

2 結(jié) 果

2.1 cDNA測(cè)序與序列分析初步結(jié)果 將消減cDNA文庫(kù)送至北京天根公司,進(jìn)行全文庫(kù)單向測(cè)序掃描。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源序列比對(duì)和BlastX分析,部分結(jié)果列于表2中。發(fā)現(xiàn)文庫(kù)中有7個(gè)EST s序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中找不到同源片段,這7個(gè)EST可能代表了新基因。另有部分基因功能與氧化還原關(guān)系密切,如SSH-18、SSH-90等。

表2 部分陽(yáng)性克隆BlastX分析結(jié)果Table 2 BlastXanalysis of the partialy clones

2.2 差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 為了更準(zhǔn)確地鑒定SSH文庫(kù)中差異表達(dá)基因的可靠性,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了5個(gè)EST在原頭蚴經(jīng)H2O2氧化脅迫處理和未處理對(duì)照中的差異表達(dá)情況,其中TPx為抗氧化基因家族中的一員,其余為功能未知基因。圖1是對(duì)這些差異表達(dá)基因3個(gè)重復(fù)樣品的解鏈曲線(xiàn)分析。從圖中可以看出,隨著溫度的升高,與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料SYBR GreenⅠ逐漸被釋放,曲線(xiàn)均無(wú)雜峰出現(xiàn),說(shuō)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)樣品污染和引物二聚體,擴(kuò)增產(chǎn)物單一,確定為特定的片段。

圖1 部分差異表達(dá)EST的融解曲線(xiàn)分析Fig.1 Melting curve analysis of differential expressed ESTs A:Differential expressed EST of TPx;B:Differential expressed EST of S88 and H32-1;C:Differential expressed EST of O68 and D12.

2.3 差異表達(dá)基因的數(shù)據(jù)整理 目標(biāo)基因與內(nèi)對(duì)照基因(ActinⅠ)Ct值的差值(△Ct)列于表3、表4中。S88、H32-1兩個(gè)基因在0.8 mmol/L H2O2氧化脅迫的原頭蚴中表達(dá)量分別達(dá)到了未經(jīng)氧化脅迫原頭蚴中的2.0和 2.3倍,在2.4 mmol/L H2O2氧化脅迫的原頭蚴中,這兩個(gè)基因的表達(dá)量分別達(dá)到了未經(jīng)氧化脅迫原頭蚴中的8.0和6.1倍。

表3 S88基因相對(duì)表達(dá)分析Table 3 The fold change in expression of the S88 gene relativeto the internal control gene(ActinⅠ)

表4 H32-1基因相對(duì)表達(dá)分析Table 4 The fold change in expression of the H32-1 gene relative to the internal control gene(ActinⅠ)

3 討 論

逆境壓力會(huì)刺激細(xì)胞產(chǎn)生氧化自由基,過(guò)量的氧化自由基卻會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞走向凋亡〔6〕。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激條件時(shí),體內(nèi)ROS產(chǎn)生增加,體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)作用增強(qiáng)〔7〕。

基因的表達(dá)量基因定量過(guò)氧化氫作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子,它可以與信號(hào)通路中蛋白質(zhì)的巰基反應(yīng),使之活化或失活,參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在哺乳類(lèi)動(dòng)物,胞間氧化還原狀態(tài)與細(xì)胞分化、免疫應(yīng)答、生長(zhǎng)控制、腫瘤發(fā)生和細(xì)胞凋亡都有著密切聯(lián)系〔8-9〕。囊型包蟲(chóng)病呈世界性分布,其流行已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題〔10-11〕。寄生蟲(chóng)通過(guò)合成抗氧化酶并大多在宿主—寄生蟲(chóng)的接觸面表達(dá)以適應(yīng)及抵抗氧化脅迫的壓力〔12-13〕?？寡趸冈诒Ｗo(hù)寄生蟲(chóng)抵御來(lái)自宿主新陳代謝和白細(xì)胞激活的ROS的氧化損傷起關(guān)鍵作用〔14〕,提示細(xì)粒棘球蚴具有抵抗氧化的機(jī)制。

在前期研究中〔4〕,對(duì)SSH技術(shù)在寄生蟲(chóng)研究領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了嘗試,構(gòu)建了H2O2脅迫PSC與正常組織差異表達(dá)的消減cDNA文庫(kù)。本研究進(jìn)一步對(duì)實(shí)驗(yàn)分離克隆到一些重要基因的cDNA序列進(jìn)行分析,這些基因編碼的產(chǎn)物功能可以大致分為兩類(lèi):第一類(lèi)是功能蛋白類(lèi),在細(xì)胞內(nèi)可直接發(fā)揮保護(hù)功能,如氧化還原酶。第二類(lèi)是調(diào)控蛋白類(lèi),在各種脅迫反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或基因表達(dá)中起調(diào)節(jié)作用,間接起保護(hù)作用,如蛋白激酶、生長(zhǎng)因子等。蛋白激酶在脅迫信號(hào)感應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)中有重要作用〔15〕。另有部分克隆在GenBank中無(wú)法查到對(duì)應(yīng)的同源基因,這些可能代表了新基因。

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),本研究所構(gòu)建的 SSH 文庫(kù)中 ,S88、H32-1 、TPx 、D12、O68 、I36、P72、I39、F21、H32-2 基因都是受 H2O2誘導(dǎo)的,而且隨著H2O2濃度不同,其表達(dá)量也有變化。當(dāng)H2 O2濃度為2.4 mmol/L時(shí),表達(dá)量為最高,說(shuō)明隨著H2O2濃度的升高,該部分基因的表達(dá)可以持續(xù)增強(qiáng)。其中,S88、H32-1基因的表達(dá)變化量分別為未經(jīng)H2O2處理對(duì)照的8.0倍和6.1倍。由此說(shuō)明所構(gòu)建的SSH文庫(kù)有效地富集了原頭蚴經(jīng)氧化脅迫特異表達(dá)的基因,可以進(jìn)一步通過(guò)反向雜交手段篩選影響原頭蚴抗氧化功能的主效基因。推測(cè),S88和H32-1等幾個(gè)新EST表達(dá)量的提高與原頭蚴的抗氧化功能密切相關(guān),可以進(jìn)一步把它們作為原頭蚴抗氧化的候選基因來(lái)進(jìn)行更深層次功能的研究。而對(duì)于TPx基因表達(dá)變化差異,在經(jīng)過(guò)H2O2濃度為0.8 mmol/L處理時(shí),其表達(dá)量表現(xiàn)有下降,當(dāng)H2O2濃度增高大于0.8 mmol/L時(shí),其表達(dá)量又增高。Real-time PCR檢測(cè)TPx表達(dá)量在經(jīng)過(guò)H2O2濃度為0.8 mmol/L處理后和對(duì)照組表達(dá)差異不大,其原因如何,還需要進(jìn)一步探討。

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The differential expression of the anti-oxidation related genes inEchinococcus granulosusby real-time PCR

HOU Qiu-lian,ZHANG Fu-chun,ZHANG Wen-bao,MAMUTI Wulamu,ZHNAG Zhuang-zhi
(Basic Medicine College of Xinjiang Medical University,Urumqi830054,China)

To isolate the specific genes in protoscoleses(PSC)ofEchinococcusgranulosusunder oxidative stresses from the SSH library constructed in the previous study,the gene expression in PSC under oxidative stresses was studied by using real-time PCR.The previously amplified library was sequenced and analyzed in GenBank with Blast research.Sequence analysis indicated that all clones in the SSH library contained the coding sequences,of which some clones showed homology in the Gen-Bank and others were unknown.Differential expression of 4 genes randomly selected and the TPx gene in this library were studied with real-time PCR.It was demonstrated that the gene expression of S88 and H32-1 in oxidative tissues was 2.0 and 2.3 times higher than the un-oxidative stresses respectively.The TPx gene was up-regulated when PSC was induced with H2H2of more than 0.8 mmol/L.These results implies that the up-regulated expression of the above-mentioned genes may be related with the related functions of anti-oxidative process in PSC and they may be used as the candidate genes for the study of anti-oxidation ofE.granulosus.

Echinococcusgranulosus;oxidative stress;suppression subtractive hybridization;real-time PCR;dfferentially expressed gene

R383.33

A

1002-2694(2010)01-0001-05

*美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院 R03基金資助項(xiàng)目(No.R03AI063367-01),國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30760229),新疆教育廳創(chuàng)新群體資助項(xiàng)目(No.XJEDU2004G02)

吾拉木?馬木提,Email:mwulamu@hotmail.com

1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原學(xué)教研室,烏魯木齊830054;

2009-04-30;

2009-11-22