易亮衡,秦永偉,陳金鈴,朱丹丹,何興新,段義農(nóng)

2.湖北省黃石市疾病預(yù)防控制中心,黃石 435000

大鼠源肺孢子菌p55基因片段真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)*

易亮衡1,2,秦永偉1,陳金鈴1,朱丹丹1,何興新1,段義農(nóng)1

目的構(gòu)建大鼠源肺孢子菌抗原p55基因片段真核表達(dá)質(zhì)粒,并研究該質(zhì)粒在真核細(xì)胞COS-7中的有效表達(dá)。方法以含有p55全長基因的質(zhì)粒為模板,通過PCR擴(kuò)增p55基因片段,克隆至pGEM-T載體中,經(jīng)酶切后再將p55基因重組至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中,構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-582,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析及測序鑒定正確后,應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞,RT-PCR檢測其基因轉(zhuǎn)錄情況,SDS-PAGE鑒定其表達(dá)相應(yīng)的目的蛋白質(zhì)情況。結(jié)果成功擴(kuò)增了p55基因片段,酶切和測序證明正確構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-582,RT-PCR和SDSPAGE方法證實(shí)該片段能在COS-7細(xì)胞中有效表達(dá)目的蛋白質(zhì)。結(jié)論成功構(gòu)建了大鼠源肺孢子菌p55基因片段的真核表達(dá)質(zhì)粒載體,并在COS-7細(xì)胞中表達(dá),為進(jìn)一步進(jìn)行核酸疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

大鼠源肺孢子菌;p55基因;真核表達(dá)

2.湖北省黃石市疾病預(yù)防控制中心,黃石 435000

肺孢子菌(Pneumocystis)是一類重要的機(jī)會性致病真菌,廣泛存在于人和哺乳動物肺組織內(nèi),可以引起肺孢子菌肺炎(Pneumocystispneumonia,PCP)。PCP目前已成為艾滋病患者最常見的機(jī)會性感染,并是其致死的主要原因〔1〕。此外,惡性腫瘤、器官移植術(shù)后、惡性營養(yǎng)不良、大量的免疫抑制劑、抗腫瘤藥物的應(yīng)用以及放射線照射等造成機(jī)體免疫功能低下也極易誘發(fā)本病〔2〕。PCP一旦發(fā)生,病情進(jìn)展迅速,病死率極高,不經(jīng)治療幾乎100%死亡,故越來越受到國內(nèi)外的重視。廣泛預(yù)防服藥使抗藥性出現(xiàn)的比率在逐漸增高,預(yù)防用藥尚不能完全預(yù)防肺孢子菌肺炎的發(fā)生。由于缺少可靠、穩(wěn)定的連續(xù)的體外培養(yǎng)體系,迄今體外培養(yǎng)技術(shù)難以提供大量肺孢子菌抗原,用肺孢子菌可溶性抗原或活肺孢子菌進(jìn)行免疫在實(shí)際工作中受到限制〔3〕。因此開展重組抗原的研究將是PCP免疫預(yù)防的一個重要課題。大鼠源肺孢子菌(pneumocystisof rats)抗原p55(Mr 55 000)是Pc的主要抗原之一。早期感染Pc宿主的肺泡灌洗液中可檢測出該抗原。Smulian 等〔4〕和 Theus等〔5〕發(fā)現(xiàn)重組 p55 蛋白能刺激宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)?；趐55抗原的研究,p55抗原可能成為PCP免疫預(yù)防的一個重要途徑。本研究采用基因克隆的方法構(gòu)建Pc p55抗原基因部分片段真核表達(dá)載體,并在COS-7細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),為進(jìn)一步開展核酸疫苗免疫特性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物模型、菌株、細(xì)胞及載體 雌性清潔級SD大鼠(南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心),Esherichia coliDH5α菌株(上海生工生物工程有限公司);COS-7細(xì)胞株(本室保存);pGEM-T載體(Promega公司);pcDNA3.1(+)(本室保存)。

1.1.2 主要試劑 基因組DNA純化試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒、柱式質(zhì)粒小量/中量抽提試劑盒(上海生工生物工程公司);XHoI、EcoRⅠ、T4連接酶、耐熱TaqDNA聚合酶(TAKARA公司);Lipotap轉(zhuǎn)染試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 參考文獻(xiàn)〔6〕方法,建立大鼠源肺孢子菌肺炎動物模型。

1.2.2 基因組DNA的提取 按文獻(xiàn)〔7〕方法,提取大鼠源肺孢子菌基因組DNA。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 根據(jù)已報道p55基因序列〔8〕設(shè)計(jì)一對引物,用Primer5.0分析軟件分析其可行性。引物序列:上游引物(P1):5＇CCGGAAT TCACCATGGATT TATGTTGT 3＇下游引物 (P2):5＇CCGCTCGAGTCAATGCGTATTATCTG 3＇,上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR 體系:模板 2μ g,上下游引物(20μ mol/L)各 1μ L,TaqDNA 聚合酶 0.5μ L,dNTP 4μ L,PCR Buffer 5μ L,MgCl25μ L,加 ddH2O 至 50μ L 。反應(yīng)按下列條件進(jìn)行:94℃3min,94℃45s,60℃45s,72℃60s,反應(yīng) 30個循環(huán),最后72℃延伸7 min,電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 pGEM-582基因克隆與鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后,回收目的條帶,與pGEM-T載體連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選白色菌落過夜培養(yǎng),質(zhì)粒抽提,酶切鑒定。

1.2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-582的構(gòu)建取適量pGEM-582基因和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒,分別用EcoRⅠ和X HoⅠ雙酶切。再進(jìn)行連接反應(yīng):10×T4 DNA連接酶 buffer 1μ L,T4 DNA連接酶(20U/μ L)1μ L,雙酶切的 pcDNA3.1(+)1μ L,雙酶切的基因片段5μ L,共10μ L體系;并以水代替目的基因片段作為對照。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α,篩選,小量擴(kuò)增后,抽提重組表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-582。

1.2.6 重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-582的鑒定用EcoRⅠ和X HoⅠ雙酶切重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-582,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定并測序。

1.2.7 重組表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-582轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞 COS-7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)傳代,至細(xì)胞60%～70%融合,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,分別將pcDNA3.1(+)-582質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。

1.2.8 RT-PCR法檢測mRNA表達(dá) 參照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行操作,常規(guī)抽提轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-582質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒的COS-7細(xì)胞中的總 RNA,分別取上述總RNA 2μ g,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈,再進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件同1.2.3。分別取少量PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測,判斷PCR產(chǎn)物大小。

1.2.9 SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá) 用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,收集轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)液,經(jīng)離心后提取上清,與加樣緩沖液混合,分別用沸水煮5 min,各取20μ L電泳,同時用細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對照。電泳結(jié)束,考馬斯亮藍(lán)染色,脫色液脫色后凝膠攝像。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠源肺孢子菌p55基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果應(yīng)用PCR擴(kuò)增大鼠源肺孢子菌p55基因得到約582 bp的條帶,與實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Analysis of PCR products by agarose gel electrophoresis

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-582的篩選、酶切及測序 從含X-gal的培養(yǎng)基中選擇白色菌落,抽提的質(zhì)粒酶切電泳顯示兩條帶,一條為插入p55基因片段約582 bp,另一條為切開的載體質(zhì)粒pcDNA3.1(+)約5.4 kb的片段(圖2)。測序結(jié)果與先前報道〔8〕一致。

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切及PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Characterization of the recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-582by restrictionenzymedigestionand PCR products

2.3 RT-PCR法檢測結(jié)果 將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-582質(zhì)粒的COS-7細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR,擴(kuò)增出pcDNA3.1(+)-582特異性基因片段,產(chǎn)物大小與預(yù)期片段大小相符(圖3)。

圖3 RT-PCR結(jié)果Fig.3 RT-PCR analysis of pcDNA3.1(+)-582 expression

2.4 SDS-PAGE結(jié)果 將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-582質(zhì)粒的COS-7細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE,在分子量約21 kDa左右的區(qū)域出現(xiàn)一特異蛋白條帶(圖4第1道),這與 p55片段蛋白大小一致,其空質(zhì)粒的細(xì)胞裂解液及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液中無此條帶(圖4中第2、3道)。

圖4 SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)Fig.4 SDS-PAGE analysis of the protein expression of pcDNA3.1(+)-582

3 討 論

大鼠源肺孢子菌55kDa蛋白(p55)是菌體的主要抗原分子之一,目前,有關(guān)p55的生物學(xué)功能并不完全清楚。Smulian等〔4〕發(fā)現(xiàn)天然 p55蛋白能刺激宿主產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng),重組p55蛋白主動免疫能夠產(chǎn)生部分免疫保護(hù)作用,因此p55抗原在宿主的免疫防御上起著重要的作用。Zheng等研究發(fā)現(xiàn)p55作為非CD4+T細(xì)胞依賴的疫苗能防止小鼠感染 Pc,認(rèn)為是最有希望的候選疫苗〔9〕。Ma等研究認(rèn)為p55抗原重復(fù)序列至少存在一個抗原表位〔10〕。p55抗原分子能引發(fā)宿主產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答及體液免疫應(yīng)答〔8〕。其原因是p55在主動免疫后,其 5＇端 p55(1-200)具有免疫原性,進(jìn)而引起細(xì)胞免疫及體液免疫〔5〕。

由脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染是將DNA導(dǎo)入細(xì)胞且重復(fù)性較好的方法之一。其原理是帶陽性電荷的脂質(zhì)體與帶陰性電荷的DNA之間可以有效地形成復(fù)合物,此復(fù)合物通過內(nèi)吞作用可進(jìn)入細(xì)胞中。存在于細(xì)胞質(zhì)中的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物仍然保持著完好的結(jié)構(gòu),并有機(jī)會以同樣的方式與細(xì)胞核膜發(fā)生相互作用,并進(jìn)入核內(nèi),從而啟動外源基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。利用這種方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后,將培養(yǎng)48 h的細(xì)胞收集起來用PBS緩沖液清洗3次后,一部分提取細(xì)胞總RNA,用克隆片段的上下游引物進(jìn)行特異性RT-PCR擴(kuò)增,結(jié)果轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的COS-7細(xì)胞RT-PCR產(chǎn)物陽性,而對照組結(jié)果陰性,表明確實(shí)有p55基因片段的RNA轉(zhuǎn)錄體產(chǎn)生,即表明p55基因的片段能夠表達(dá);一部分進(jìn)行SDSPAGE分析,結(jié)果顯示細(xì)胞裂解液中有p55基因片段蛋白的產(chǎn)生,而空質(zhì)粒的細(xì)胞裂解液及細(xì)胞培養(yǎng)液中無相應(yīng)蛋白產(chǎn)生。

真核表達(dá)的質(zhì)粒DNA可在多種組織細(xì)胞表達(dá)外源蛋白質(zhì)。本研究所用細(xì)胞系為COS細(xì)胞系,COS細(xì)胞系是進(jìn)行外源性DNA真核表達(dá)最常用的宿主細(xì)胞之一,對SV40系列載體轉(zhuǎn)染具較高敏感性。在常規(guī)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中,每個COS細(xì)胞可積聚大于105個帶SV40復(fù)制起點(diǎn)的重組表達(dá)質(zhì)粒,且能高效表達(dá)重組表達(dá)質(zhì)粒所攜帶的外源DNA片段。所采用的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)含有一定數(shù)量的CpG寡核苷酸序列。這種在原核生物基因組中以一定頻率存在的未甲基化CpG二核苷酸,能夠在動物體內(nèi)通過一系列連鎖反應(yīng),而激活機(jī)體的免疫系統(tǒng),放大抗原的免疫效應(yīng),而具有免疫佐劑的功能。導(dǎo)入個體的疫苗DNA被B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞內(nèi)吞后,質(zhì)粒中的CpG寡核苷酸序列可被宿主細(xì)胞識別,并激活核因子NF-κ B(NFkappaB),從而誘導(dǎo)IL-6、IL-12和干擾素等細(xì)胞因子分泌,進(jìn)而產(chǎn)生一定的免疫應(yīng)答。

本研究成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-582。采用了脂質(zhì)體包裹瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,結(jié)果表明pcDNA3.1(+)-582重組質(zhì)粒能成功轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的 COS-7細(xì)胞并在mRNA水平及蛋白水平上均檢測到有效表達(dá)。為進(jìn)一步深入進(jìn)行大鼠源肺孢子菌p55抗原基因片段核酸疫苗的免疫特性研究奠定了基礎(chǔ)。

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Construction and expression of the eukaryotic expression vector containing the p55 gene fragment of ratPneumocystis

YI Liang-heng,QIN Yong-wei,CHEN Jin-ling,ZHU Dan-dan,HE Xing-xin,DUAN Yi-nong

(Department of Parasitology,School of Medicine,Nantong University,Nantong226001,China)

To construct the eukaryotic expression plasmid containing the p55 gene fragment ofPneumocystisand to investigate the efficient expression in COS-7 cells,the gene fragment conaining the whole length of p55 gene was used as template to amplify this fragment with PCR and the amplified fragment was then cloned to vector pGEM-T.After enzyme digestion,p55 gene was cloned to the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)to construct the plasmid pcDNA3.1(+)-582.This plasmid was then transfected to the eukaryotic expression cells COS-7 and PCR and SDS-PAGE assays were used to confirm the presence of target protein in these cells.In these ways,the eukaryotic expression vector for the p55 gene ofPneumocystisof rats was successfully constructed and expressed in COS-7 cells,thus providing the basis for further studies on the nucleic acid vaccine.

Pneumocystisof rats;p55 gene fragment;eukaryotic expression

R382.9

A

1002-2694(2010)01-0025-04

*南通大學(xué)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.08Z044)

段義農(nóng),Email:ynduan@126.com

1.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室,南通 226001;

2009-07-13;

2009-10-11