陳 茹,畢英佐,劉志玲,劉志輝,馬靜云,曾碧健,吳曉薇,周 科,林志雄

2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué);

3.廣州市胸科醫(yī)院;

四種重要致病性分枝桿菌DHPLC檢測(cè)鑒別方法的建立*

陳 茹1,畢英佐2,劉志玲2,劉志輝3,馬靜云2,曾碧健1,吳曉薇1,周 科1,林志雄1

目的運(yùn)用多重核酸擴(kuò)增(PCR)聯(lián)合變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)分析技術(shù)原理,針對(duì)結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、禽分枝桿菌以及副結(jié)核分枝桿菌建立多重PCR-DHPLC快速檢測(cè)方法,實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)鑒別四種重要致病性分枝桿菌。方法根據(jù)四種分枝桿菌特異基因序列分別設(shè)計(jì)菌種特異核酸擴(kuò)增引物,通過篩選優(yōu)化試驗(yàn)建立四重核酸擴(kuò)增體系,對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物采用DHPLC設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)分析,每一菌種的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物分別形成DHPLC特征峰圖。對(duì)結(jié)核分枝桿菌等51株分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和分離株樣品以及沙門氏菌等22株常見微生物樣品進(jìn)行特異性檢測(cè)試驗(yàn);對(duì)四種分枝桿菌特異的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物分別制備克隆質(zhì)粒,通過對(duì)梯度稀釋的陽性質(zhì)粒的檢測(cè)試驗(yàn),進(jìn)行多重PCR-DHPLC靈敏度測(cè)試;對(duì)疑似病人痰液樣品和疑似發(fā)病牛的組織樣品進(jìn)行檢測(cè),并與細(xì)菌分離培養(yǎng)法進(jìn)行比較以驗(yàn)證臨床檢測(cè)效果。結(jié)果該方法能快速檢測(cè)鑒別上述四種分枝桿菌,檢測(cè)靈敏度達(dá)到102～103基因拷貝,從131份疑似病人臨床樣品中檢出91份結(jié)核分枝桿菌陽性,從40份來自疑似發(fā)病牛群的臨床樣品中檢出31份牛分枝桿菌陽性,檢出率均高于細(xì)菌分離培養(yǎng)法。結(jié)論研究表明所建立的多重PCR-DHPLC方法能快速檢測(cè)鑒別四種重要致病性分枝桿菌,為人畜結(jié)核、副結(jié)核病診斷提供一種新型分子生物學(xué)技術(shù)手段。

變性高效液相色譜;結(jié)核分枝桿菌;牛分枝桿菌;禽分枝桿菌;副結(jié)核分枝桿菌;多重PCR

2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué);

3.廣州市胸科醫(yī)院;

Email:chenr@iqtc.cn;ychenru@sina.com

分枝桿菌在自然界廣泛存在,迄今已發(fā)現(xiàn)的有上百種,多數(shù)菌種對(duì)人畜有致病性〔1〕。其中,結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)與牛分枝桿菌(M.bovis)主要感染人與哺乳動(dòng)物引起結(jié)核病;禽分枝桿菌(M.avium)感染禽類引起禽結(jié)核,也可感染人與家畜引起非典型肺炎;副結(jié)核分枝桿菌(M.paratubercu-losis)在分類上屬禽分枝桿菌復(fù)合群,主要感染牛、羊等反芻動(dòng)物引起副結(jié)核病。結(jié)核病危害嚴(yán)重,已成為全球主要公共衛(wèi)生問題。結(jié)核病、副結(jié)核病均為國際動(dòng)物貿(mào)易重點(diǎn)監(jiān)控疫病,我國動(dòng)物進(jìn)出境檢疫工作規(guī)定對(duì)這兩種疫病實(shí)施嚴(yán)格的檢疫。結(jié)核、副結(jié)核病的診斷主要涉及上述四種重要致病性分枝桿菌的檢測(cè)鑒別。

分枝桿菌具有形態(tài)與結(jié)構(gòu)相似,抗原交叉嚴(yán)重,常規(guī)診斷方法不易區(qū)分的特點(diǎn),且各種分枝桿菌可在人畜禽間感染傳播。準(zhǔn)確檢測(cè)鑒別不同致病性分枝桿菌可幫助查清結(jié)核病、副結(jié)核病傳染源和傳播途徑,避免由于常規(guī)診斷方法特異性不理想造成錯(cuò)誤撲殺動(dòng)物等不必要的經(jīng)濟(jì)損失。另一方面,禽分枝桿菌等非結(jié)核分枝桿菌感染人引起的臨床癥狀和病理變化與結(jié)核分枝桿菌的感染相似,而由于對(duì)抗結(jié)核藥物不敏感,對(duì)大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌需采取不同的治療手段〔1〕。因此,針對(duì)重要致病性分枝桿菌建立菌種特異的檢測(cè)鑒定方法具有重要的流行病學(xué)意義和臨床診療意義。

變性高效液相色譜(Denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技術(shù)是一種利用離子對(duì)反相液相色譜技術(shù)原理進(jìn)行核酸片段的分離和分析的新型核酸分析技術(shù),可應(yīng)用于進(jìn)行微生物檢測(cè)鑒別,具有高通量和自動(dòng)化,準(zhǔn)確性好,成本低等優(yōu)勢(shì),國內(nèi)外已見報(bào)道用于進(jìn)行大腸桿菌等食品微生物的檢測(cè)鑒別〔2-4〕、致病微生物耐藥菌株的鑒別篩選以及遺傳疾病的基因診斷〔5-7〕等。DHPLC技術(shù)根據(jù)核酸檢測(cè)分析要求,可采用非變性、部分變性和完全變性幾種不同的分析模式,基于核酸擴(kuò)增片段差異的微生物鑒別檢測(cè)技術(shù)采用非變性分析模式。本文采用多重核酸擴(kuò)增與非變性DHPLC分析相結(jié)合的技術(shù)原理,首次建立了同時(shí)快速檢測(cè)鑒別結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、禽分枝桿菌和副結(jié)核分枝桿菌的四重PCR-DHPLC高通量檢測(cè)分析方法,詳見如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 副結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國獸醫(yī)與藥品監(jiān)督所(CVCC),其余分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株均源自美國ATCC菌種保藏中心,卡介苗干粉(BCG)為蘭州生物制品研究所產(chǎn)品(凍干皮內(nèi)注射用卡介苗,批號(hào)20000912,含 106菌細(xì)胞/mg以上);結(jié)核分枝桿菌分離株樣品由廣州市胸科醫(yī)院分離保存,牛分枝桿菌分離株樣品由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)保存,禽分枝桿菌分離株樣品、副結(jié)核分枝桿菌分離株樣品由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)保存。其它各種微生物標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品均購自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心(CMCC)或美國ATCC菌種保藏中心,分離株樣品由汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心提供。詳見表1。

1.1.2 主要試劑 PCR擴(kuò)增用酶,采用TOYOBO公司KOD-PLUS DNA polymerase。三乙胺乙酰鹽(T EAA,色譜純)購自T ransgenomic公司,乙睛(色譜純)購自TEDIA公司。

1.1.3 主要儀器 變性高效液相色譜儀(Transgenomic Wave 4500),核酸擴(kuò)增儀(PE2700)。

1.2 目標(biāo)基因選擇與引物設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),選取各菌種特異序列,采用專業(yè)軟件設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)擴(kuò)增引物。結(jié)核分枝桿菌引物設(shè)計(jì)以該菌種基因組中一段特異的12.7kb插入序列(GenBank Accession No.:CP000717)為模板,擴(kuò)增產(chǎn)物 213 bp,對(duì)應(yīng)模板1702125bp～1702337bp位點(diǎn)(5'～3')序列;牛分枝桿菌引物設(shè)計(jì)以該菌種特異的一段229bp序列(GenBank Accession No.:AM408590)為模板,擴(kuò)增產(chǎn)物241bp,對(duì)應(yīng)模板1721081bp～1721321bp位點(diǎn)序列;副結(jié)核分枝桿菌引物設(shè)計(jì)以IS900插入序列(GenBank Accession No.:AY660657)為模板,擴(kuò)增產(chǎn)物302bp,對(duì)應(yīng)模板61bp～361bp位點(diǎn)序列;禽分枝桿菌引物設(shè)計(jì)以IS1245插入序列(GenBank Accession No.:L33879)為模板,擴(kuò)增產(chǎn)物265bp,對(duì)應(yīng)模板88bp～352bp位點(diǎn)序列。

1.3 分枝桿菌基因組DNA提取 從菌液、痰液、血液中提取分枝桿菌核酸的方法按文獻(xiàn)〔8〕進(jìn)行。從淋巴結(jié)、肺等臨床樣品中提取分枝桿菌核酸按以下方法操作:取適量淋巴結(jié)等組織(剔除脂肪、筋膜),按1∶2(W/V)加檸檬酸鈉-磷酸緩沖液,充分研磨成乳劑,加等量4%NaOH溶液繼續(xù)研磨使組織液化,75℃溫浴0.5～1 h,取懸浮液(避免吸取粗渣),高速離心取沉淀,加滅菌0.01 mol/L pH 7.6 PBS 1mL洗 2次,取沉淀,加入 50 μ L DNA 提取液,56℃溫浴30 min,98℃～100℃溫浴10 min,加入等體積氯仿,振蕩混勻后,離心取上清直接用于擴(kuò)增反應(yīng)。

1.4 陽性克隆質(zhì)粒 通過PCR擴(kuò)增各菌種特異基因片段(含1.2對(duì)應(yīng)PCR產(chǎn)物),按常規(guī)基因克隆操作把PCR產(chǎn)物分別克隆到pMD19-T載體,構(gòu)建的克隆質(zhì)粒pMD19-M T,pMD19-MB,pMD19-PB9,pMD19-MA12質(zhì)粒分別含結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌、禽分枝桿菌特異擴(kuò)增序列,可作為本研究DHPLC檢測(cè)陽性對(duì)照模板及敏感性試驗(yàn)?zāi)０濉?/p>

表1 試驗(yàn)菌種與編號(hào)列表Table 1 List of tested bacterial strains

1.5 多重PCR體系和擴(kuò)增條件 通過對(duì)引物用量、擴(kuò)增循環(huán)條件等因素的比對(duì)優(yōu)化試驗(yàn),確定最佳反應(yīng)體系如下:采用50μ L反應(yīng)體系,反應(yīng)液中含dNTP 0.2 mmol/L,八條引物每條各 0.2 μ mmol/L,Mg2+1.0 mmol/L,1 unit Taq酶;擴(kuò)增循環(huán)條件為:94℃2min;94℃15s,62℃5s,68℃5s,35個(gè)循環(huán);72℃,1min。

1.6 DHPLC分析條件 在非變性分析模式下,采用雙鏈DNA多片段(double-stranded multiple fragment)分析模式,清洗模式采用active,樣品進(jìn)樣量設(shè)為5μ L。分析檢測(cè)過程儀器梯度參數(shù)由Navigator software分析軟件控制設(shè)定。

1.7 臨床樣品的細(xì)菌分離培養(yǎng) 采用改良羅氏培養(yǎng)法,其中人臨床樣品的細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定試驗(yàn)由廣州市胸科醫(yī)院按醫(yī)院標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程完成;動(dòng)物臨床樣品的細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定試驗(yàn)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)按標(biāo)準(zhǔn)方法(GB/T 18645-2002)完成。

1.8 特異性試驗(yàn) 采用1.6的四重PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件,對(duì)表1中各菌種基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,按1.6進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的DHPLC檢測(cè)分析,對(duì)所建立的四重PCR-DHPLC體系進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.9 敏感性試驗(yàn) 按1.4制備各菌種對(duì)應(yīng)的陽性模板克隆質(zhì)粒,對(duì)四種質(zhì)粒進(jìn)行提取純化后,測(cè)OD260吸光度值并換算成濃度值,根據(jù)公式:質(zhì)?？截悢?shù)/μ l={總含量(μ g/μ l)}/{質(zhì)粒分子堿基數(shù) ×10-15μ g},換算成質(zhì)粒單位體積對(duì)應(yīng)的基因拷貝數(shù),然后將每種質(zhì)粒DNA分別進(jìn)行10倍系列稀釋,取每一稀釋度質(zhì)粒DNA樣品進(jìn)行四重PCR-DHPLC分析,每個(gè)稀釋度均做2次以上重復(fù)試驗(yàn),根據(jù)檢測(cè)終點(diǎn)稀釋度推算檢測(cè)終點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因拷貝數(shù)。

1.10 臨床檢測(cè)試驗(yàn) 取臨床采集的人痰液樣品、牛(淋巴結(jié)、牛肺)組織樣品,分別進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)和四重PCR-DHPLC檢測(cè)分析,并對(duì)2種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 四重PCR-DHPLC特異性試驗(yàn)結(jié)果 按1.5、1.6對(duì)表1所列的50株分支桿菌菌株樣品和沙門氏菌等24株其它微生物樣品進(jìn)行四重PCR擴(kuò)增和DHPLC分析。結(jié)果顯示,四重PCR-DHPLC能同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)鑒別結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌與禽分枝桿菌,對(duì)這四種目標(biāo)菌種的標(biāo)準(zhǔn)株和分離株樣品的檢測(cè)分析結(jié)果均出現(xiàn)相符的DHPLC特征峰圖,而同時(shí)檢測(cè)其它分枝桿菌以及各種常見微生物樣品均無非特異性反應(yīng),在DHPLC分析圖譜中未出現(xiàn)與上述四種目標(biāo)菌種一致的特征峰圖。圖1顯示上述四種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株單重模板以及四重模板(即將四種分枝桿菌DNA樣品等量混合后作為四重?cái)U(kuò)增的模板)擴(kuò)增產(chǎn)物的DHPLC分析標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜,圖中還顯示部分陰性菌株樣品的檢測(cè)圖譜。圖2分別顯示四種分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)株與分離株樣品的檢測(cè)分析結(jié)果,結(jié)果表明每一菌種的標(biāo)準(zhǔn)株與分離株樣品均呈現(xiàn)穩(wěn)定的DHPLC特征圖譜。

圖1 分枝桿菌的DHPLC特征圖譜1:四重菌種模板檢測(cè)圖譜;2:結(jié)核分枝桿菌;3:牛分枝桿菌;4:禽分枝桿菌;5:副結(jié)核分枝桿菌;6:部分陰性菌種檢測(cè)圖譜.Fig.1 DHPLC standard chart of Mycobacteria strains1.Quadruplex templates;2.M.tuberculosis;3.M.bovis;4.M.avium;5.M.paratuberculosis;6.Negative strains.

2.2 四重PCR-DHPLC敏感性試驗(yàn) 按1.9進(jìn)行敏感性試驗(yàn)與數(shù)據(jù)處理,以1.4所列四種陽性克隆質(zhì)粒DNA系列稀釋的樣品為模板,進(jìn)行四重PCR擴(kuò)增和DHPLC分析檢測(cè)。結(jié)果顯示,四重 PCRDHPLC對(duì)結(jié)核分枝桿菌,牛分枝桿菌,副結(jié)核分枝桿菌,禽分枝桿菌陽性模板克隆質(zhì)粒的檢測(cè)敏感性可達(dá) 10-8到10-9稀釋度,相當(dāng)于約102～103個(gè)基因拷貝。

2.3 臨床樣品檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果 從醫(yī)院肺炎門診采集疑似病人痰樣131份,從呈現(xiàn)疑似臨床癥狀的牛群中采集牛肺、牛淋巴結(jié)、牛血液等臨床樣品40頭份,采用四重PCR-DHPLC方法和細(xì)菌分離培養(yǎng)方法分別進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)。檢測(cè)結(jié)果,采用兩種方法均從人痰樣中檢出結(jié)核分枝桿菌陽性樣品(未檢出其它3種分支桿菌),四重PCR-DHPLC方法的檢出率為69.5%(91/131),細(xì)菌分離培養(yǎng)法的檢出率為63.3%(83/131);采用兩種方法均從牛臨床樣品中檢出牛分枝桿菌陽性(未檢出其它3種分枝桿菌),四重PCR-DHPLC方法和細(xì)菌分離培養(yǎng)法檢出率分別為77.5%(31/40)、62.5%(25/40)。對(duì)171份臨床樣品的檢測(cè)試驗(yàn)表明,四重PCR-DHPLC方法對(duì)人與動(dòng)物臨床樣品的檢出率均高于細(xì)菌分離培養(yǎng)方法,其中,細(xì)菌分離培養(yǎng)呈陽性的樣品均呈PCRDHPLC陽性。詳見表2。

圖2 四種分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)株與分離株DHPLC檢測(cè)分析結(jié)果Fig.2 DHPLC analysis of different strains of four species of Mycobacterium.

3 討 論

傳統(tǒng)的分枝桿菌檢測(cè)鑒定方法包括鏡檢法和細(xì)菌分離培養(yǎng)法。鏡檢法敏感性低,不能進(jìn)行菌種鑒定,而培養(yǎng)法耗時(shí)長。由于分枝桿菌生長緩慢,細(xì)菌分離培養(yǎng)常需數(shù)周時(shí)間,培養(yǎng)后還需進(jìn)行各種繁瑣的生化反應(yīng)才能鑒定菌種,同時(shí)必須是“活菌”才能培養(yǎng)成功,因此傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢查鑒定方法有其局限性,不利于疫情疫病快速確診和臨床治療,也不能適應(yīng)人員或動(dòng)物進(jìn)出境檢驗(yàn)檢疫快速通關(guān)要求。

表2 四重PCR-DHPLC與細(xì)菌分離培養(yǎng)對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果比對(duì)Table 2 Comparison of quadruple PCR-DHPLC and culture method for detection of clinical samples

近年來,以PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR為代表的分子生物學(xué)技術(shù)在結(jié)核或副結(jié)核病原菌快速檢測(cè)鑒定方面發(fā)展較快〔8-10〕,但均為針對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群或副結(jié)核分枝桿菌等單一菌種,其中以熒光PCR方法最為敏感,但成本較高。由于多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)還不成熟,對(duì)于同時(shí)檢測(cè)多種相近的病原菌需要建立多套熒光PCR方法,在實(shí)際應(yīng)用方面成本高的問題更為突出。因此,在重要致病性分枝桿菌快速檢測(cè)鑒定方面進(jìn)行新方法、新技術(shù)手段的研究開發(fā)具有現(xiàn)實(shí)意義。結(jié)核與副結(jié)核病的診斷涉及到多種致病性分枝桿菌的檢測(cè)鑒別,適合運(yùn)用DHPLC等高通量檢測(cè)技術(shù)手段。目前已報(bào)導(dǎo)的相關(guān)DHPLC技術(shù)研究主要用于進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的篩選鑒別〔11-12〕,即對(duì)分離培養(yǎng)獲得的純菌株采用DHPLC變性分析模式尋找確認(rèn)耐藥基因突變位點(diǎn)。在不同種分枝桿菌鑒別方面,僅有國內(nèi)1篇文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)采用DHPLC異源雙鏈突變檢測(cè)分析方法(部分變性分析模式)鑒別結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌〔13〕,僅限于對(duì) 1～2株標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)。

國際上DHPLC技術(shù)的相關(guān)研究進(jìn)展迅速,已成為核酸分析技術(shù)研究與應(yīng)用的一個(gè)熱點(diǎn)。采用DHPLC技術(shù)一次可自動(dòng)分析數(shù)十甚至數(shù)百個(gè)樣品,實(shí)現(xiàn)了對(duì)核酸分子的高通量自動(dòng)化分析,其特征圖譜可精確到幾個(gè)堿基的差異,不僅避免了常規(guī)PCR電泳檢測(cè)的繁瑣和易造成污染等問題,準(zhǔn)確性也顯著提高,其試劑成本僅相當(dāng)于常規(guī)PCR,在實(shí)際應(yīng)用方面有優(yōu)勢(shì)。將DHPLC技術(shù)與核酸擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合建立新型核酸分析手段,在微生物的快速檢測(cè)鑒別等方面具有很大的開發(fā)應(yīng)用潛力。本研究采用多重核酸擴(kuò)增聯(lián)合非變性DHPLC分析方法,對(duì)結(jié)核分枝桿菌等四種重要致病性分枝桿菌建立了PCR-DHPLC鑒別檢測(cè)分析手段。與國內(nèi)報(bào)導(dǎo)的單重PCR擴(kuò)增聯(lián)合DHPLC分析檢測(cè)微生物的研究工作不同,本研究可通過一次反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)鑒別四種目標(biāo)菌種,當(dāng)待檢樣品中僅含有一種菌種時(shí),其DHPLC分析圖譜僅出現(xiàn)一個(gè)特征峰型,當(dāng)樣品中同時(shí)含有多個(gè)目標(biāo)菌種時(shí),其DHPLC分析圖譜將同時(shí)呈現(xiàn)多個(gè)吸收峰(如圖1)。

建立特異穩(wěn)定的多重核酸擴(kuò)增體系是多重DHPLC分析方法重要的技術(shù)內(nèi)容。由于四種致病性分枝桿菌的核酸同源性高,其中結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌的基因組序列同源性高達(dá)99%〔14〕,而副結(jié)核分枝桿菌在分類上與禽分枝桿菌均屬禽分枝桿菌復(fù)合群,針對(duì)這四種分枝桿菌設(shè)計(jì)多重?cái)U(kuò)增引物并建立多重?cái)U(kuò)增體系難度較大。本研究在文獻(xiàn)檢索的基礎(chǔ)上,通過對(duì)多條基因序列的比對(duì)分析,篩選確定了每一種分枝桿菌的目標(biāo)基因,并通過大量檢測(cè)試驗(yàn)篩選出各菌種的特異引物并確定四重體系中的引物組合。在多重?cái)U(kuò)增體系反應(yīng)條件方面,通過檢測(cè)試驗(yàn)篩選了具有高保真和熱啟動(dòng)功能的DNA聚合酶,并通過梯度試驗(yàn)確定了采用高退火溫度的擴(kuò)增循環(huán)反應(yīng)條件,確保了擴(kuò)增反應(yīng)特異高效。

DHPLC分析結(jié)果表明,四種分枝桿菌菌種均呈現(xiàn)獨(dú)特的DHPLC特征圖譜(圖1),每一菌種的標(biāo)準(zhǔn)株和分離株樣品均呈現(xiàn)穩(wěn)定的DHPLC峰圖(圖2),重現(xiàn)性好;對(duì)十幾種分枝桿菌的檢測(cè)結(jié)果顯示,不同菌種之間沒有出現(xiàn)交叉反應(yīng),表明所建立的PCR-DHPLC體系特異性好、穩(wěn)定可靠。臨床檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果表明,多重PCR-DHPLC方法能快速檢測(cè)鑒定人或動(dòng)物感染的結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌,檢出率高于細(xì)菌分離培養(yǎng)方法,而檢測(cè)周期小于1d,表明臨床適用性好。

本研究通過對(duì)多種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離株樣品、常見微生物樣品、陽性模板克隆質(zhì)粒以及人與動(dòng)物臨床樣品的檢測(cè)試驗(yàn),表明所建立的多重PCRDHPLC檢測(cè)分析技術(shù)能同時(shí)檢測(cè)鑒別四種重要致病性分枝桿菌,達(dá)到特異靈敏、快速高效的目的,可用于臨床快速檢測(cè)結(jié)核、副結(jié)核致病菌感染,也可用于對(duì)培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行菌種快速鑒定,適合在進(jìn)出境檢驗(yàn)檢疫、公共衛(wèi)生和動(dòng)物疫病診斷和防控、流行病學(xué)調(diào)查研究等領(lǐng)域推廣應(yīng)用。

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Establishment of the denaturing high-performance liquid chromatography combined with multiplex nucleic acid amplification method for rapid identification of four important pathogenic mycobacteria

CHEN Ru,BI Ying-zuo,LIU Zhi-ling,LIU Zhi-hui,MA Jing-yun,ZENG Bi-jian,WU Xiao-wei,ZHOU Ke,LIN Zhi-xiong

(Guangdong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou510635,China)

A new molecular method for simultaneously rapid detection and differentiation ofMycobacteriumtuberculosis,Mycobacterium bovis,Mycobacterium aviumandMycobacterium paratuberculosiswas established by using denaturing highperformance liquid chromatography(DHPLC)combined with multiplex nucleic acid amplification.These 4 important pathogenic mycobacteria were identified by separation of 4 specific PCR-amplified target fragments by DHPLC analysis.A total of 51Mycobacteriumstrains and 22 other bacterial species were tested to confirm the specificity of the multiplex PCR-DHPLC assay.The sensitivity of the assay was as low as 102-103gene copies.This method rapidly identify the positive clinical samples from human and bovine with higher detection ratio than traditional culture method and was able to identify simultaneously four pathogenicMycobacterium,which provided a new molecular tool for rapid detection of tuberculosis and paratuberculosis in human and animals.

denaturing high-performance liquid chromatography;Mycobacterium tuberculosis;Mycobacterium bovis;Mycobacterium avium;Mycobacterium paratuberculosis;multiplex PCR

R535

A

1002-2694(2010)01-0041-05

*國家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目(2006IK019)

1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣州 510623;

2009-08-17;

2009-11-22