趙振祥,崔步云,李蘭玉,趙鴻雁,樸冬日,郝素珍

2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所,北京102206

布魯氏菌的脂肪酸分型研究*

趙振祥1,崔步云2,李蘭玉2,趙鴻雁2,樸冬日2,郝素珍1

目的探索脂肪酸分型方法對布魯氏菌進行分型的可能性。方法選擇90株布魯氏菌經化學方法提取菌體脂肪酸后,用氣相色譜分析,獲得布魯氏菌脂肪酸成分的數(shù)據資料。并利用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對獲得的數(shù)據資料進行聚類分析。結果布魯氏菌脂肪酸分型方法將90株布魯氏菌分為5組:第1組為部分牛種菌;部分羊種菌;部分豬種菌;部分綿羊附睪種;部分變異牛種;部分變異羊種;沙林鼠種標準株。第 2組為豬種 1、2、3、5型標準株和疫苗株 S2;羊種疫苗株 M28和Rev.1;綿羊附睪種標準株。第3組為部分羊種;部分變異羊種菌;部分牛種 3型和6型;犬種;部分綿羊附睪種。第 4組為犬種菌標準株。第5組為部分羊1型;部分變異羊種;部分牛1型;部分豬1型和3型。結論依據布魯氏菌菌體脂肪酸含量差異可以對布魯氏菌進行分型;依據19∶0CYCLOω 8c,18∶1ω 7c,16∶0三種脂肪酸含量差異可以區(qū)分豬種布魯氏菌和犬種布魯氏菌;脂肪酸分型結果進一步提示犬種布魯氏菌不只1個生物型;脂肪酸分型結果進一步證實牛3型和牛6型布魯氏菌高度同源。

布魯氏菌;氣相色譜;脂肪酸;聚類分析;分型

2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所,北京102206

布魯氏菌是一種胞內寄生兼性厭氧的革蘭陰性微小球桿菌,其傳統(tǒng)分類鑒定方法是根據培養(yǎng)生物特性、氧化代謝和抗原特征、噬菌體裂解特點以及主要宿主等不同,將布魯氏菌屬分為6個種19個生物型。它是聯(lián)合國糧農組織和世界衛(wèi)生組織布病專家委員會于1986年公布的,已獲得國際社會公認。并且經過多年的實踐檢驗被證明是一種很好的分型方法,在布病的防治工作中發(fā)揮了積極而重要的作用。但是,在實際分型工作中已經遇到一些使用傳統(tǒng)分型方法無法將其分型的菌株,不僅表明傳統(tǒng)的布魯氏菌分型方法尚存在一定的缺陷,更重要的是嚴重影響對布病疫區(qū)分類的判定,從而不能對此采取合理有效的預防控制措施。因此,需要進一步完善或者尋找新的分型方法以解決布魯氏菌分型中遇到的問題。

1963年Able〔1〕率先將氣相色譜應用于腸桿菌的菌體脂肪酸成分分析,創(chuàng)建了一個全新的細菌化學分類方法。隨著分析儀器和分析軟件的逐漸完善,細菌菌體脂肪酸成分分析已經成為微生物化學分類方法的重要組成部分。對金黃色葡萄球菌、洋蔥伯克霍爾德菌、銅綠假單胞菌等的研究表明,菌體脂肪酸成分分析能給出可靠的分型結果,可用于追溯傳染源等流行病學研究〔2〕。我國學者對分枝桿菌〔3〕、鼠疫耶爾森菌〔4〕、念珠菌〔5〕、霍亂弧菌〔6〕等進行了脂肪酸分型研究,其中對部分細菌的分型取得了滿意結果。

1977 年和 1981 年 Tanaka〔7〕,Dees〔8〕等曾用氣相色譜測定了部分布魯氏菌脂肪酸的組成,認為脂肪酸分型技術對布魯氏菌的分型有一定意義。本研究用氣相色譜獲得布魯氏菌脂肪酸成分的數(shù)據資料,并利用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對獲得的數(shù)據資料進行聚類分析,探索對我國分離到的布魯氏菌分型的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株 布魯氏菌的19個標準株、7個疫苗株,及我國分離到的56個典型布魯氏菌菌株和8個非典型布魯氏菌菌株。

1.2 培養(yǎng)條件 菌株均接種于布魯氏瓊脂(brucella agar,美國BBL公司)平板培養(yǎng)基上,35℃培養(yǎng)48h。

1.3 菌體脂肪酸甲酯的提取 4mm接種環(huán)收獲培養(yǎng)48h的菌體一環(huán)置于冷凍干燥管中,加1mL MIDI溶液1(45g NaOH溶于150 mL CH3OH及150 mL H2O),封口,沸水浴30min皂化;冷卻后轉移至8 mL螺口管中,加2 mL MIDI溶液2(190 mL濃鹽酸,275 mL CH3OH溶于135 mL H2O),蓋嚴震蕩,80℃±1℃水浴10 min甲酯化,冰浴冷卻;加 1.25 mL MIDI溶液3(200 mL正己烷,200 mL乙醚混勻)萃取脂肪酸甲酯;加3 mL MIDI溶液4(10.8 g NaOH溶于900 mL H2O)萃取。取2/3上層有機相盛至2 mL氣相色譜樣品瓶中備用。

1.4 氣相色譜分析系統(tǒng)及色譜條件 脂肪酸甲酯分析使用HP6890氣相色譜儀,配備自動進樣器,氣相色譜條件參照MIDI Sherlock推薦方法設置;Sherlock系統(tǒng)根據流出組分的等值碳鏈長度(ECL)值進行脂肪酸成分的定性,并通過百分歸一化進行各組分的相對定量。

1.5 聚類圖的繪制 用SPSS11.5軟件系統(tǒng)分析所得各實驗菌株脂肪酸組成,繪制實驗菌株基于菌體脂肪酸成分的聚類圖。本研究使用的聚類分析方法為層次聚類中的類間平均連鎖法。

2 結 果

2.1 部分菌株脂肪酸的氣相色譜檢測結果 從圖1和圖2可以看出,82號菌株在保留時間為8.180 min,13.397 min,15.274 min時有3條較高的峰出現(xiàn),分別代表脂肪酸15∶0ANTEISO,18∶1ω 7c,19∶0CYCLOω 8c,經計算含量分別為 13.95%,27.77%和 26.15%。75號菌株在保留時間為10.222 min,13.372 min時有兩條較高的峰出現(xiàn),分別代表脂肪酸 16∶0和 18∶1ω 7c,經計算含量為8.34%和85.18%?？梢钥闯?依據峰的面積和位置的不同可以區(qū)別不同的菌株,即可以根據脂肪酸含量和種類的差異對布魯氏菌鑒定和分型。

2.2 本研究90株布魯氏菌的聚類結果 圖3將90株布魯氏菌分為5組:第1組為部分牛種菌;部分羊種菌;部分豬種菌;部分綿羊附睪種;部分變異牛種;部分變異羊種;沙林鼠種標準株。第2組為豬種1、2、3、5型標準株和疫苗株S2;羊種疫苗M28和Rev.1;綿羊附睪種標準株。第3組為部分羊種;部分變異羊種菌;部分牛種3型和6型;犬種;部分綿羊附睪種。第4組為犬種菌標準株。第5組為部分羊1型;部分變異羊種;部分牛1型;部分豬1型和3型。

圖3 90株布魯氏菌的聚類圖Fig.3 Dendrogram of 90 experimental strains

3 討 論

3.1 采用脂肪酸分型技術對90株布魯氏菌分型的初議 采用脂肪酸分型技術對布魯氏菌分型的結果顯示我國分離到的64株布魯氏菌被分到三個組,絕大多數(shù)被分入第1組,少數(shù)被歸到第3組和第5組,第1組又可以分為牛種菌和羊種菌兩個小組,但其中又有個別相互交錯的現(xiàn)象。但沒有菌株分離時間、地點、宿主的分布特征。從脂肪酸分型結果可以發(fā)現(xiàn),它與傳統(tǒng)分類方法分型結果存在一致性又有差異,這說明傳統(tǒng)分類方法與菌株脂肪酸組成既有聯(lián)系又有區(qū)別。Rep-PCR分型結果〔9〕和 PFGE分型結果〔10〕也與傳統(tǒng)分類方法分型結果存在差異,但也與脂肪酸分型結果有差異,且這4種方法得到的結果兩兩互不相同。哪種分型方法更能反映布魯氏菌的進化關系和分類地位,用于溯源工作,尚需進一步研究。但傳統(tǒng)分類方法,脂肪酸分型、Rep-PCR分型和PFGE分型都從不同側面反映了布魯氏菌的細菌分類特點。由此可見,布魯氏菌的脂肪酸分型方法有其特有的優(yōu)勢,可作為布魯氏菌屬細菌鑒定、分類的補充技術。

3.2 脂肪酸組成分析對某些種、型布魯氏菌的分類探索

3.2.1 犬種布魯氏菌的分類 國內分離到的犬種菌和犬種菌標準株 RM6/66的脂肪酸含量與種類差異較大,提示犬種菌可能不只1個生物型。Rep-PCR分型技術就將犬種布魯氏菌分為3組,其中典型犬種菌分到兩個不同組〔9〕。PFGE分型結果也顯示犬種菌之間的相似度較差〔10〕。Vizcaino N.等采用PCR-RFLP方法對布魯氏菌omp-31基因的研究中,犬種布魯氏菌也被分為兩組〔11〕。關于犬種布魯氏菌的種型問題,根據細菌對硫堇和復紅的耐受,1985年Corbel等〔12〕對世界上收集的 62株犬種布魯氏菌鑒定表明,對兩種染料的耐受分為4種,尚德秋〔13〕等對143株犬種布魯氏菌的鑒定分為6種狀態(tài),綜合分析,根據犬種布魯氏菌對兩種染料的狀況可以分為兩個型。64號菌株是我國于1987年從牛體分離到的犬種菌,而從牛體分離到犬種菌在國際上目前只有這1例,這株菌經傳統(tǒng)分類方法鑒定為犬種菌〔14〕。脂肪酸分型結果印證了這株菌確是犬種菌。

3.2.2 豬種布魯氏菌和犬種布魯氏菌的脂肪酸組成差異 豬種布魯氏菌依據脂肪酸含量差異分為3組,第一組以16∶0,19∶0CYCLOω 8c,18∶1ω 7c三種脂肪酸為主。第二組以15∶0ANTEISO,18∶1ω 7c,19∶0CYCLOω 8c為主。第三組以 15∶0ANTEISO,15∶0ISO,16∶0ISO為主。所有的犬種布魯氏菌含19∶0CYCLOω 8c很低,一組以18∶1ω 7c為主,另一組以16∶0為主。因此,區(qū)分這兩種布魯氏菌時僅僅根據19∶0CYCLOω 8c來判定是不充分的,還應結合18∶1ω 7c,16∶0來判定,完善了Dees等〔8〕提出的觀點。

3.2.3 牛種3型和牛種6型布魯氏菌脂肪酸對比本研究中很多牛種3型和牛種6型布魯氏菌脂肪酸含量非常相似,符合傳統(tǒng)方法鑒定結果。因為牛種3型和牛種6型在生物學特性上十分相似,在它們之間僅有對硫堇敏感性的明顯差別,在硫堇為40 μ g/mL時,牛種3型生長而牛種6型不生長。Tolari等〔15〕就曾提出牛種布魯氏菌3和6生物型是一個生物型,建議分類為牛種布魯氏菌3/6生物型。脂肪酸分型的研究進一步證實了牛種3型和牛種6型布魯氏菌高度同源。

3.3 非典型布魯氏菌菌株的歸屬 本研究選用了8株非典型布魯氏菌菌株,應用脂肪酸分型方法可以在分類表中找到合適的位置,但僅限于種的水平,不能具體到型的水平上,可作為傳統(tǒng)分類方法的補充。

本研究采用脂肪酸分型技術對90株布魯氏菌進行分型鑒定研究,并與傳統(tǒng)分類方法、Rep-PCR和PFGE分型技術進行對比、討論與分析。我們認為,布魯氏菌屬細菌的脂肪酸組成可以從另一個側面反映布魯氏菌鑒定分類特點。這4種分類方法各不相同,各具特色,相互不能替代。需要對這幾種鑒定結果綜合分析,乃至采用其它分型方法進行分類、對比,方能對布魯氏菌屬細菌的進化關系予以進一步澄清?？咳魏螁我患夹g與方法都很難判定菌株歷史進化地位。

(感謝軍事醫(yī)學科學院微生物流行病學研究所劉海洪博士和楊瑞馥教授及中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所尚德秋研究員和李元凱研究員的指導。)

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Typing on the cellular fatty acids ofBrucellaspecies by Gas-chromatography analysis

ZHAO Zhen-xiang,CUI Bu-yun,LI Lan-yu,ZHAO Hong-yan,PIAO Dong-ri,HAO Su-zhen

(Departmentof Microbiology and Immunology,Shanxi Medical University,Taiyuan030001,China)

To investigate the the possibility to utilize the cellular fatty acid(CFA)information as a method inBrucellatyping,90Brucellastrains were subjected to the study on CFAs,and all the experimental strains were inoculated onBrucellaAgar plates for 48 hours.After that,cells were harvested,saponificated,methylated and extracted to provide fatty acids methylesters for gas chromatography analysis.Based on the CFAs data matrix,dendrogram of 90 experimental strains was generated by SPSS11.5 software package.As shown in the dendrogram,90Brucellastrains could be divided into 5 clusters.The first cluster included some species ofBrucellaabortus,Brucella melitensis,Brucella suis,Brucellaovis;and some of the variant strains ofBrucellaabortus andBrucellamelitensis and the typical strain ofBrucellaneotomae.The second cluster included typical strains ofBrucella suis(1,2,3 and 5 types);vaccine strains ofBrucella suisS2;vaccine strains ofBrucellamelitensisM28、Rev.1 and typical strain ofBrucella ovis.The third cluster included some ofBrucella melitensis;some of the variant strains ofBrucella melitensis;some ofBrucellaabortus(3,6 types);Brucella canisandBrucella ovis.The fourth cluster was the typical strain ofBrucella canis.and the fifth cluster included some ofBrucellamelitensis(1 type);some ofBrucellaabortus(1 type);some of the variant strains ofBrucella melitensisandBrucella suis(1,3 type).It is apparent that CFAs information can be used in brucella typing.andBrucellasuisandBrucella caniscan be distinguished by the difference in the CFA contents of 3 fatty acids 19∶0CYCLOω 8c,18∶1ω 7c and 16∶0.The results of CFAs typing inBrucellaspecies show thatBrucella canisincludes 2 biovars at least and the high homologization ofBrucella abortus(3 type)andBrucella abortus(6 type)can be found.

Brucella;gas-chromatography;fatty acids;cluster analysis;typing

R378.5

A

1002-2694(2010)01-0013-04

*國家“973”計劃資助項目(F973_2002CB513206)

崔步云,Email:cuibuyun@icdc.cn

1.山西醫(yī)科大學微生物學與免疫學教研室,太原030001;

2009-04-21;

2009-11-25