高江婧, 嚴(yán)群, 阮文權(quán)＊

(1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122;3.江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院,江蘇無錫 214122)

一株產(chǎn)L-乳酸菌株的篩選、鑒定及營養(yǎng)條件的初步研究

高江婧1, 嚴(yán)群2,3, 阮文權(quán)＊2,3

(1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122;3.江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院,江蘇無錫 214122)

作者對篩選的一株產(chǎn)L-乳酸的菌株進(jìn)行了菌種鑒定,根據(jù)16S rDNA序列測定結(jié)果,結(jié)合其形態(tài)特征及生理生化性質(zhì),確定該菌株為凝結(jié)芽孢桿菌(B acillus coagulans)。進(jìn)一步對其營養(yǎng)條件進(jìn)行了研究,初步確定玉米糖化液為最適碳源,采用1 g/dL酵母粉與1 g/dL棉籽蛋白的混合氮源,L-乳酸產(chǎn)量不僅有所提高且成本大大降低,金屬離子Mn2+、Fe2+、Mg2+都可在一定程度上提高L-乳酸的產(chǎn)量。

細(xì)菌鑒定;16S rDNA;凝結(jié)芽孢桿菌;L-乳酸

乳酸是目前世界上公認(rèn)的3大有機(jī)酸之一,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、制革、紡織、環(huán)保和農(nóng)業(yè)等諸多領(lǐng)域[1]。特別是以L-乳酸為原料生產(chǎn)的生物可降解性塑料——聚乳酸,對于解決日益嚴(yán)重的白色污染問題有重要的意義。近年來關(guān)于L-乳酸的研究報道很多,發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸的菌種主要有根霉和細(xì)菌兩大類。與根霉好氧發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸相比,乳酸細(xì)菌發(fā)酵法具有糖轉(zhuǎn)化率高、無通氣能量消耗、成本低等優(yōu)點[2]。因此篩選L-乳酸產(chǎn)生菌具有重要意義。

目前文獻(xiàn)報道細(xì)菌乳酸發(fā)酵的較高水平有趙博等人[3]以葡萄糖為碳源,添加豆粕水解液和玉米漿作為輔料,2 L罐培養(yǎng)120 h,L-乳酸質(zhì)量濃度可達(dá)202 g/L,糖轉(zhuǎn)化率91.3%。丁紹峰等[4]采用指數(shù)流加發(fā)酵使總?cè)樗豳|(zhì)量濃度達(dá)210 g/L,其中L-乳酸質(zhì)量濃度達(dá)180 g/L。雖然產(chǎn)量很高,但仍存在發(fā)酵周期長、生產(chǎn)效率低或光學(xué)純度低等缺點。作者對實驗室分離出的一株產(chǎn)L-乳酸的菌株進(jìn)行了生理生化試驗、糖發(fā)酵試驗及16S rDNA序列測定,確定該菌株為凝結(jié)芽孢桿菌。為進(jìn)一步了解該菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的能力,對其營養(yǎng)條件進(jìn)行了初步研究。由于乳酸細(xì)菌發(fā)酵法對氮源的要求較高,從而使生產(chǎn)成本偏高,因此降低氮源的成本具有很大的現(xiàn)實意義,作者亦在降低氮源成本方面做了嘗試。

1 材料與方法

1.1 菌種的篩選與鑒定

1.1.1 菌種的篩選 采集某奶制品企業(yè)附近離地面約3～10 cm的土樣,樣品經(jīng)增殖、稀釋后涂布CaCO3-溴鉀酚紫平板培養(yǎng)基,待長出菌落后,挑選可水解CaCO3且變色圈大的菌株,經(jīng)搖瓶發(fā)酵后,選取L-乳酸產(chǎn)量高且光學(xué)純度高的菌株并將其保藏。

1.1.2 菌體形態(tài)觀察及生理生化實驗 參照文獻(xiàn)[5]。

1.1.3 糖類發(fā)酵實驗 參照文獻(xiàn)[6]。

1.1.4 分子生物學(xué)鑒定 染色體DNA的提取,菌株16S rDNA的擴(kuò)增、16S rDNA序列的測定以及BLAST比對均參照文獻(xiàn)[7]。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 分離平板培養(yǎng)基 CaCO3-溴鉀酚紫平板培養(yǎng)基。

1.2.2 搖瓶種子培養(yǎng)基與搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[8]。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子培養(yǎng) 從培養(yǎng)24 h的斜面上挑取一環(huán)菌體接入液體種子培養(yǎng)基,45℃、120 r/min搖床培養(yǎng)18 h。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)良好的種子按體積分?jǐn)?shù)10%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,45℃、120 r/min搖床培養(yǎng)72 h。

1.4 分析方法

1.4.1 乳酸質(zhì)量濃度 采用高效液相色譜儀(Agillent 1100,美國)。具體色譜條件:色譜柱為美國Merck公司的ZORBAXSB-Aq,150 mm× 4.6 mm(直徑5μm),流速0.5 mL/min,檢測波長210 nm,進(jìn)樣量10μL,柱溫30℃。

1.4.2 L-乳酸質(zhì)量濃度 用SBA-40C生物傳感分析儀測定。L-乳酸質(zhì)量濃度與乳酸總質(zhì)量濃度之比即為L-乳酸的光學(xué)純度。

1.4.3 殘?zhí)琴|(zhì)量濃度 DNS法。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的鑒定結(jié)果

經(jīng)初篩得到42株產(chǎn)酸圈較大的菌株,經(jīng)搖瓶試驗后得到菌株ES23,其L-乳酸產(chǎn)量最高,達(dá)到47.74 g/L,且光學(xué)純度達(dá)到99.3%,選擇該菌株做進(jìn)一步研究。由圖1可知,菌株在平板上的單菌落呈圓形,稍透明,邊緣整齊,菌落呈乳白色,菌落直徑約為2.0～2.5 mm。在光學(xué)顯微鏡下觀察可知,菌體為桿狀,少數(shù)稍彎曲,單個排列,長約3.0～5.0 μm。細(xì)菌革蘭氏染色呈陽性。在一定條件下可產(chǎn)生芽孢,為端生。無鞭毛,能運動,為兼性厭氧菌。

圖1 菌落形態(tài)Fig.1 Colony shape

將試管中斜面培養(yǎng)保藏的菌株活化3代后接種到生化試驗培養(yǎng)基中,培養(yǎng)后測定其生化特性。結(jié)果見表1。菌株對不同碳水化合物的利用情況見表2。

由表1生理生化特性的測定結(jié)果可知,該菌株過氧化氫酶為陽性,VP陽性,明膠液化陰性,可分解利用淀粉。由表2可知,該菌株能利用大多數(shù)寡糖,包括纖維二糖和菊粉,但不能分解利用木糖和鼠李糖。同時做了產(chǎn)氣實驗,結(jié)果均不產(chǎn)氣。此外,糖類發(fā)酵實驗中添加了指示劑溴甲酚紫,若菌株能利用某種糖,培養(yǎng)基顏色可由紫變黃,根據(jù)變色時間的長短可判斷分解某種糖的快慢程度。實驗發(fā)現(xiàn),該菌能迅速利用葡萄糖、麥芽糖、果糖、半乳糖和糊精;而需要較長時間才能分解乳糖、蔗糖、纖維二糖、菊粉和淀粉。

表1 菌株的生理生化實驗結(jié)果Tab.1 Results of physiological and biochemical characteristics

表2 菌株對不同碳水化合物的利用情況Tab.2 Utilize ability of carbon source

所測菌株的16S rDNA核苷酸序列為1 464 bp。將所測序列從GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)菌種進(jìn)行比較,結(jié)果表明:該菌株與芽孢桿菌屬B acillus coagulans具有極高的同源性,為99%。結(jié)合以上生理生化結(jié)果,參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[9]分析比較,其生理生化指標(biāo)均相同,可確定該菌株為凝結(jié)芽孢桿菌。該菌種在利用五碳糖方面與研究報道不相一致。Milind A[10]報道其分離的凝結(jié)芽孢桿菌可利用分解利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乳酸,而該菌株不能分解利用五碳糖。

2.2 碳源對發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

實驗選取葡萄糖、玉米糖化液、馬鈴薯淀粉糖化液,木薯糖化液,菊粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源,其中初糖質(zhì)量濃度為90 g/L,氮源為酵母粉與蛋白胨。并且,玉米淀粉、馬鈴薯淀粉及木薯粉均采用高溫淀粉酶及α-糖化酶進(jìn)行雙酶水解。由圖2可知,葡萄糖和玉米糖化液的L-乳酸產(chǎn)量最高,分別為49.62 g/L和49.25 g/L,其次為馬鈴薯淀粉糖化液、木薯糖化液和菊粉。前期研究發(fā)現(xiàn),該菌株可分解利用非糧作物菊粉,但幾乎不產(chǎn)L-乳酸,僅可從液相圖譜中檢測到乙酸、琥珀酸等雜酸。由此說明,葡萄糖是使代謝途徑大量積累乳酸的最佳碳源,考慮到成本,作者選用玉米糖化液為碳源。

圖2 不同碳源對L-乳酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on L-lactic acid production

為確定碳源初始水平,以玉米糖化液為碳源,考察其對該菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的影響,結(jié)果見圖3。

圖3 碳源質(zhì)量濃度對L-乳酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of concentration of glucose acid production on L-lactic acid production

當(dāng)初糖質(zhì)量濃度低于120 g/L時,隨著初糖質(zhì)量濃度的增大,L-乳酸產(chǎn)量依次增大;當(dāng)初糖質(zhì)量濃度高于120 g/L時,L-乳酸產(chǎn)量下降,較高的底物質(zhì)量濃度會使培養(yǎng)基滲透壓增大,導(dǎo)致菌體不能很好的生長和產(chǎn)酸。初糖質(zhì)量濃度為105 g/L和120 g/L時,乳酸產(chǎn)量相差不大,分別為58.87 g/L和60.07 g/L,而后者糖的轉(zhuǎn)化率相對較低。因此最佳的碳源質(zhì)量濃度為105 g/L。

2.3 氮源對發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

實驗選取了一些常見氮源,包括酵母粉、蛋白胨、牛肉膏等優(yōu)質(zhì)有機(jī)氮源,還包括一些廉價氮源,有豆餅粉、麥根、玉米漿、棉籽蛋白,發(fā)酵結(jié)果見圖4。從圖4可以看出,所有氮源中,酵母粉單獨作為氮源時,L-乳酸產(chǎn)量最高,為52.03 g/L,這可能與酵母粉中富含豐富的氨基酸和維生素等生長因子有關(guān)。在廉價氮源中,玉米漿單獨做氮源時L-乳酸產(chǎn)量相對較高,為18.24 g/L。用牛肉膏單獨做氮源時,在所稀釋范圍內(nèi)未檢測到L-乳酸,但從液相色譜圖中可以檢測到較多的丙酮酸、乙酸以及琥珀酸。由此可說明,營養(yǎng)環(huán)境條件的變化對該乳酸菌的代謝途徑改變很大。

圖4 不同氮源對L-乳酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on L-lactic acid production

雖然使用酵母粉單獨做碳源時L-乳酸產(chǎn)量最高,但相比其他氮源來說,酵母粉價格高昂,這將嚴(yán)重阻礙乳酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。為減少成本,設(shè)計了幾組不同的氮源組合,將酵母粉與一些廉價氮源混合發(fā)酵,結(jié)果見表3。

表3 復(fù)合氮源對L-乳酸發(fā)酵的影響Tab.3 Effect of mixed nitrogen sources on L-lactic acid production

由表3可知,在廉價氮源中,玉米漿單獨作氮源時L-乳酸產(chǎn)量較高,但與酵母粉混合后產(chǎn)量反而降低。豆餅粉、棉籽蛋白以及大豆蛋白胨單獨做氮源時,L-乳酸產(chǎn)量很低,但與酵母粉混合后,產(chǎn)酸量都得到了較大的提高,說明這3種氮源的營養(yǎng)成分與酵母粉的生長因子起到了很好的相互補(bǔ)充的作用。L-乳酸產(chǎn)量隨酵母粉添加量的增加而升高,其中大豆蛋白胨與酵母粉混合后,當(dāng)酵母粉添加量由0.5 g/dL增加到1 g/dL時,L-乳酸產(chǎn)量增加了近3倍。雖然1 g/dL酵母粉與0.5 g/dL大豆蛋白胨混合后產(chǎn)酸量最高,為73.06 g/L,但大豆蛋白胨價格相比豆餅粉和棉籽蛋白來說仍較高,因而氮源應(yīng)選取1 g/dL酵母粉與1 g/dL棉籽蛋白,其產(chǎn)酸量為60.89 g/L,此時L-乳酸產(chǎn)量不僅有所提高且成本降低。

2.4 金屬離子對發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

微生物在生長繁殖和產(chǎn)物合成中都需要無機(jī)鹽和一些微量元素,這些物質(zhì)在較低的質(zhì)量濃度時會促進(jìn)菌體的生長和產(chǎn)酸,而在高質(zhì)量濃度時常表現(xiàn)出顯著的抑制作用。作者考察了MnSO4·H2O, FeSO4·7H2O及MgSO4·7H2O對L-乳酸發(fā)酵的影響。結(jié)果見表4。由表4可知,Mn2+、Fe2+、Mg2+都可在一定程度上提高L-乳酸產(chǎn)量,其最佳質(zhì)量濃度分別為0.05,0.04,0.6 g/L。

表4 金屬離子對L-乳酸發(fā)酵的影響Tab.4 Effect of metal ions on L-lactic acid production

3 結(jié) 語

作者對實驗室分離出的一株產(chǎn)L-乳酸的菌株進(jìn)行了生理生化試驗、糖發(fā)酵試驗、16S rDNA序列測定,確定該菌株為凝結(jié)芽孢桿菌。為進(jìn)一步了解該菌株生產(chǎn)L-乳酸的能力,對其營養(yǎng)條件進(jìn)行了研究,初步確定玉米糖化液為最適碳源,其最佳質(zhì)量濃度為105 g/L;復(fù)合氮源中1 g/dL酵母粉和0.5 g/dL大豆蛋白胨L-乳酸產(chǎn)量最高;而1 g/dL酵母粉與1 g/dL棉籽蛋白混合后產(chǎn)酸量雖較前者有所降低,但成本已大大降低。金屬離子Mn2+、Fe2+、Mg2+都可在一定程度上提高L-乳酸產(chǎn)量。

采用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的產(chǎn)量雖不及當(dāng)前國內(nèi)外所報道的產(chǎn)量,但該菌有很多優(yōu)點,如該菌株光學(xué)純度高,產(chǎn)芽孢可使保藏容易,發(fā)酵溫度較高可耐高溫發(fā)酵,并且培養(yǎng)基可以在未滅菌的條件下發(fā)酵,這將節(jié)約因滅菌而消耗的能量,從而降低發(fā)酵成本。若對該菌株進(jìn)行菌種改造,或通過發(fā)酵過程優(yōu)化、代謝流量控制等措施來進(jìn)一步提高其合成L-乳酸的能力,那么該菌將是很有潛力的一株發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的菌株。

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(責(zé)任編輯:李春麗)

Screening,Identification of a Bacteria Strain for the Production of L-lactic Acid

GAO Jiang-jing1, YAN Qun2,3, RUAN Wen-quan＊2,3
(1.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3.School of Environmental and Civil Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

A bacteria strain was isolated and identified for L-lactic acid production in this study, The isolated strain was identified asB acillus coagulansbased on the results of 16S rDNA,the physiological characteristicsandthebiochemicalproperties.Thentheoptimumnutrient conditions was determined by the single factor experiments and list as fellows:10.5 g/dL corn syrup,1 g/dL yeast extract,1 g/dL cotton-seed protein.Furthermore,it was found that the presence of Mn2+、Fe2+and Mg2+in the medium can enhance L-lactic acid production.

identification,16SrDNA,B acillus coagulans,L-lactic acid

TQ 920.1

:A

1673-1689(2010)03-0453-05

2009-03-12

江蘇省科技支撐-社會發(fā)展項目(BE 2008607)。

＊通訊作者:阮文權(quán)(1966-),男,上海人,工學(xué)博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事環(huán)境生物技術(shù)方面的研究。Email:wqruan@jiangnan.edu.cn。