馬 莉，馬梁明

(山西大同大學醫(yī)學院，山西大同 037009）

格列衛(wèi)對惡性淋巴瘤細胞Raji凋亡和增殖的實驗研究

馬 莉，馬梁明

(山西大同大學醫(yī)學院，山西大同 037009）

目的研究不同濃度格列衛(wèi)對惡性淋巴瘤細胞株Raji細胞的影響.方法采用MTT法檢測不同濃度格列衛(wèi)對Raji細胞在不同時間的生長抑制作用，應用流式細胞術檢測藥物對Raji細胞Caspase-3的表達及G1期、S期占整個細胞周期的比例，采用免疫組化SABC法檢測藥物對Raji細胞P16蛋白的表達.結果格列衛(wèi)使細胞存活率明顯下降(P＜0.05)；未能上調Caspase-3表達(P＞0.05)；無明顯誘導凋亡作用(P＞0.05)；格列衛(wèi)在低濃度72 h與高濃度48 h、72 h時P16蛋白表達與對照組相比有顯著差異(P＜0.05)；格列衛(wèi)對Raji細胞G1期、S期所占細胞周期的比例與對照組相比無顯著差異 (P＞0.05).結論STI571在高濃度時可以上調Raji細胞P16蛋白的表達；STI571對惡性淋巴瘤細胞株Raji細胞無上調Caspase-3表達及影響細胞周期的作用.

亞砷酸 格列衛(wèi) 淋巴瘤 Caspase-3 P16 細胞周期

淋巴瘤治療通常以聯(lián)合化療及放療為主，對于難治及晚期患者可通過造血干細胞移植進行治療，雖然預后有一定的改善，但仍有部分患者達不到完全緩解或緩解后復發(fā)，這就迫使我們去改進對淋巴瘤的治療方法.近年來國內外學者用人類第一分子靶向藥物——基因產(chǎn)物格列衛(wèi)(STI571)治療慢性髓性白血病獲得可喜成就.但其在淋巴瘤的研究尚屬實驗階段，國外文獻報道[1]格列衛(wèi)對部分表達c-kit受體的淋巴瘤有作用，但在淋巴瘤中的抗腫瘤作用還未明確.本課題將此藥對淋巴瘤細胞株Raji增殖及凋亡作一研究，從而為臨床研究淋巴瘤提供實驗依據(jù).

1 材料

Raji細胞株 (中科院上海生物細胞庫)，STI571 (瑞士諾華公司中國分公司)，RPMIl640培養(yǎng)基 (美國GIBCO公司)，胎牛血清 (杭州四季青生物制品廠)，SABC檢測試劑盒 (武漢博士德生物制品有限公司),Caspase-3鼠抗人單抗IgG (鄭州生物制品廠)，P16小鼠抗人單抗IgG(北京中杉公司)，MTT( Sigma公司)，HEPES(北京夏斯生物技術有限公司).

2 方法

2.1 藥物配置

STI571用三蒸水配成5.0mmol/L，使用濃度為0.0、10.0和25.0μmol/L.

2.2 細胞培養(yǎng)

將 Raji細胞培養(yǎng)在含 10% 胎牛血清 RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃恒溫、體積分數(shù)為5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，換液一次，取對數(shù)生長期細胞分別加入不同濃度 STI571(0.0、10.0和 25.0 μmol/L)不同時間(24、48和72 h)收獲.以未加藥同期培養(yǎng)的細胞作為陰性對照.

2.3 采用噻唑藍(MTT)還原法檢測藥物對細胞的

抑制率

取96孔培養(yǎng)板，每孔加入藥物處理后的細胞懸液200μL，每種藥物濃度為一組，每組設8個平行孔，培養(yǎng)不同的時間.然后每孔加入MTT(5mg/mL) 20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后，棄上清液，加二甲基亞楓(DMSO)150μL，顯微鏡下觀察著色顆粒消失后，選擇490 nm為測試波長，在(MTT)自動酶標儀上測定各孔吸光度OD值.抑制率計算公式為：

細胞生長抑制率＝(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%.

2.4 流式細胞儀檢測Caspase-3的表達率

將不同濃度藥物處理不同時間后的Raji細胞調至1x106/mL，收集細胞懸液，標記，清洗，離心，棄上清液.分別加入1%FACS液500μL，破膜，離心棄

2.5 免疫組化觀察P16的表達

將藥物處理后細胞制成細胞涂片,采用SABC法，免疫組化染色步驟按試劑盒提供的程序進行.Raji細胞P16蛋白陽性評判標準：凡細胞核或(和)胞漿中出現(xiàn)明顯的棕色或棕黃色染色為陽性反應細胞.每組選擇高倍鏡下10個有代表性的視野，放大倍數(shù)為40×10，用BX51型Olympus光學顯微鏡結合BI-2000數(shù)碼顯微醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)對玻片進行圖像分析，以平均光密度值對其中的陽性染色進行分析.

2.6 流式細胞儀檢測細胞周期

將不同濃度藥物處理不同時間后的Raji細胞調至1x106/mL，收集細胞懸液離心、去上清，加入75%冰乙醇打勻固定，4℃過夜，離心、去上清，PBS洗滌1次，加入含Triton-X-100、枸櫞酸納、5mg/mL碘化丙啶(PI)的染液0.5mL染色，用流式細胞儀作細胞周期分析.

2.7 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義，MTT、Caspase-3及免疫組化的實驗結果用兩因素三水平析因設計，細胞周期結果用方差分析進行設計.

3 結果

3.1 MTT法分析藥物對Raji細胞的生長抑制率

STI571與空白對照組相比差異有顯著性 (P＜0.05），使細胞存活率明顯下降(見表1).

表1 藥物對Raji細胞生長抑制率(MTT法)(n=3)/%

3.2 流式細胞儀進行Caspase-3含量的測定

Raji細胞經(jīng)不同濃度 STI571作用不同時間后，凋亡率未發(fā)生明顯變化(P＞0.05)，STI571對Raji細胞無明顯誘導凋亡的作用(見表2).

表2 Caspase-3檢測結果(n=3)/%

3.3 免疫組化分析P16的表達

STI571在10.0μmol/L 72 h與25.0μmol/L 48 h、72 h時P16蛋白平均光密度值與對照組相比有顯著差異(P＜0.05).

表3 P16蛋白光密度檢測結果(n=3)

3.4 流式細胞儀進行細胞周期DNA含量的測定

STI571對Raji細胞 G1期、S期占細胞周期的比例無明顯影響(P＞0.05).

表4 流式細胞儀測定細胞周期比例結果(n=3)/%

4 討論

淋巴瘤是一組原發(fā)于淋巴-網(wǎng)狀組織的惡性克隆性疾病，雖然其對各種化療敏感，但易復發(fā)，易產(chǎn)生耐藥，病情遷延不愈，預后較差.STI571，商品名為格列衛(wèi) (Gleevec)，化學名為4-[(4-甲基-4-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-{[4-(吡啶)-2-嘧啶]氨基}苯基]-苯胺甲磺酸鹽，屬于2-苯氨基嘧啶的衍生物.最初STI571是針對慢性粒細胞白血病(CML)的分子起因設計的，是第一個用于臨床治療惡性腫瘤的細胞信號傳導抑制劑.研究發(fā)現(xiàn)，STI571通過與ATP競爭性結合酪氨酸激酶催化部位的核苷酸結合位點，使得底物的酪氨酸殘基不能被磷酸化，從而導致細胞增殖受抑，誘導細胞凋亡.

實驗中，應用MTT還原法檢測藥物對細胞抑制率的時候發(fā)現(xiàn)STI571對細胞的生長都有一定的抑制作用，其抑制活性呈劑量和時間依賴性.

細胞內半胱氨酸蛋白水解酶Caspase家族成員的瀑布式激活反應是凋亡過程中的一個重要事件.現(xiàn)在認為Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶.研究結果顯示[2]，STI571引起K562細胞凋亡時檢測到了Caspase-3的相對分子質量為20× l03亞單位，因為Caspase-3水解后相對分子質量就是約為 10×l03及 20×103的亞單位，所以 STI571引起K562細胞凋亡需要Caspase-3的參與，但國外文獻報道 STI571對骨髓瘤細胞作用不是通過Caspase-3途徑[3].為證實STI571是否可通過激活Caspase-3誘導淋巴瘤細胞的凋亡，實驗中選用10.0μmol/L和25.0μmol/L的STI571作用淋巴瘤細胞株Raji細胞，結果顯示，細胞Caspase-3活性未發(fā)生明顯上調，與對照組相比無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05).因此，實驗結果顯示 STI571并不能通過Ccaspase-3途徑來誘導Raji細胞凋亡.

c-kit受體分布于細胞表面，是干細胞因子(Stem cell factor，SCF)受體，屬于膜受體，是III型酪氨酸蛋白激酶受體，參與細胞的增殖、凋亡和分化.STI571能阻斷c-kit基因產(chǎn)物，抑制酪氨酸激酶活化，阻斷活化胞漿內的轉錄因子，從而誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖、提高細胞分化.對于非霍奇金淋巴瘤c-kit受體表達國外研究認為，非霍奇金淋巴瘤細胞表面c-kit受體多數(shù)呈部分表達，部分缺失.Aldinucci D[4]研究顯示CD30+淋巴瘤上有c-kit受體表達，Rassidakis GZ[1]等同樣以CD30+的霍奇金細胞和間變型大細胞淋巴瘤細胞為研究對象，通過RT-PCRm、Western blot及流式細胞術發(fā)現(xiàn)在這些細胞上均未檢測到 c-kit的mRNA和蛋白表達，認為c-kit受體在這些瘤細胞上表達很稀少，而將STI571應用于這些細胞后發(fā)現(xiàn)STI571對瘤細胞亦無明顯抑制作用，所以認為STI571對這些淋巴瘤無效.Brauns T[5]等人研究發(fā)現(xiàn)在各型原始皮膚T細胞淋巴瘤上很少有c-kit受體的表達.我們研究結果顯示，隨STI571濃度增加，Caspase-3含量逐漸增加，雖然與對照組比較無明顯統(tǒng)計學差異，但提示劑量與其有關，且在同一濃度下，隨時間的延長，Caspase-3含量也有增加趨勢，雖然無統(tǒng)計學差異，但也提示時間與其有關，所以我們認為 STI571對 Raji細胞主要作用不是啟動胞內Caspase-3途徑誘導淋巴瘤細胞凋亡.這可能是因為細胞膜表面的c-kit受體表達較少，如果是采用大劑量STI571是否可以啟動 Caspase-3途徑則有待于進一步實驗研究.

細胞增殖周期異常與腫瘤細胞的惡性增殖密切相關，實驗中應用流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，未加藥組瘤細胞基本處在S期，且多為超二倍體，應用STI571后，各期細胞所含的數(shù)目與未加藥組相比無明顯改變，不同濃度的STI571對Raji細胞的細胞周期無明顯影響，也未出現(xiàn)細胞凋亡峰，其可能原因是c-kit受體表達較少，難以啟動胞內Caspase-3途徑，也進一步證實了 STI571對Raji細胞無凋亡作用.

P16蛋白又稱多腫瘤抑制基因1(Multiple tumor suppressor 1，MTS-1)，對細胞周期G1期有特異性調節(jié)作用[6].當P16基因突變、缺失時，將刺激細胞分裂向癌變發(fā)展.國內外文獻報道[7-8]，在惡性淋巴瘤細胞中P16基因表達異常[9-10]，P16蛋白表達與非霍奇金淋巴瘤分期和分型呈負相關，惡性度增殖越活躍，蛋白表達率越降低，說明P16蛋白表達對細胞增殖有負相關調控作用.國外文獻報道STI571可上調U266細胞周期抑制蛋白P16、P16的表達水平，阻滯瘤細胞于G0/G1期，進而阻斷細胞周期的進程[8]，但STI571對淋巴瘤P16蛋白表達的研究報道較少見，從而啟示我們將此藥物應用于淋巴瘤細胞中，觀察P16蛋白的表達情況.本實驗中，將不同濃度的STI571經(jīng)不同時間作用于Raji細胞中，結果顯示STI571對Raji細胞P16的表達并無顯著影響.應用10.0μmol/L的STI571時，P16蛋白在用藥后雖有增長趨勢，但只在72 h時出現(xiàn)明顯差異，25.0μmol/L時，P16蛋白在48 h及72 h時間點上與對照組相比出現(xiàn)顯著差異，所以提示實驗所取的STI571濃度及藥物作用時間對P16蛋白的表達產(chǎn)生一定的影響，不同濃度的STI571經(jīng)不同作用時間對Raji細胞產(chǎn)生不同的作用效果.

綜上所述，一般濃度下STI571對Raji細胞的凋亡可能無影響，高濃度時可以上調P16蛋白的表達，因此，將STI571用于淋巴瘤的治療還有一定的爭議，需要進一步研究分析.

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Experimental Study of G leevec in M alignant Lym phoma Raji Cell Apoptosis and Proliferation

MA Lin，MA Liang-ming
(School ofMedicine，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009)

Objective To investigate the effect of gleevec with different concentration on Raji cells and the mechanisms Methods The inhibition of cell proliferation wasmeasured by MTT assay to assess the cells survival after STI571 treatment with different concentration at indicated time.Caspase-3 activeness changeswere determined by flow cytometry(FCM)after treatmentwith STI571 in different concentration at indicated time.The relative number of cells in different phases and the percentages of cells calculated in G1and S phase of the cell cycle were assessed by FCM after treatment with STI571 in different concentration at indicated time.The expression of p16protein was analysed by SABC immunohistochemical method after treatment with STI571 in different concentration at indicated time.Results The results of MTT assay showed that STI571 could inhibit Raji cells growth.There was clear statistical significance between the union groups and the single-drug group(P＜0.05).Raji cell lines were less sensitive to gleevec(P＞0.05).At higher concentration and longer time，STI571 could up-regulated the optical density of P16protein.And it was found that STI571 had no effecton Raji cell cycle.(P＞0.05).Conclusions The results showed that STI571 might affect the expression of P16protein athigher concentration.

acenious acid;gleevec；lymphoma；caspase-3；P16；cell cycle

R733

A

1674-0874(2010)02-0065-04上清液，清洗，各加入Caspase-3 10μL，靜置，用流式細胞儀分析細胞凋亡，實驗每組重復3次.

〔編輯 楊德兵〕

2010-01-05

馬莉(1978-)，女，山西清徐人，碩士，助教，研究方向：淋巴瘤.