王玉 伍鳳云 劉丹 林芬
(1江西省中醫(yī)藥研究院 南昌 330046;2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院2008級研究生 江西南昌 330006;3南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院2009級研究生 江西南昌 330006)
地龍為環(huán)節(jié)動物門鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓、通俗毛蚓、威廉環(huán)毛蚓或櫛肓毛蚓的干燥體,其性咸寒,是我國重要且歷史悠久的中藥材之一,具有多方面的藥理作用,如抑制血小板聚集[1]、降壓[2]、平喘[3]等。本文對地龍?zhí)崛∥飳w外神經(jīng)細胞細胞增殖情況的影響進行研究,旨在尋找合適的體外藥物濃度為臨床給藥劑量提供參考?,F(xiàn)將結(jié)果報道如下:
1.1 實驗細胞 神經(jīng)母細胞株SH-SY5Y:江西省中醫(yī)藥研究院中心實驗室凍存。
1.2 試劑DMEM培養(yǎng)基 GIBCOBRL產(chǎn)品(批號:1024265,貨號:12100-038);小牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司(批號:060209);胰蛋白酶:Sigma產(chǎn)品(批號:4977,效價為 1:250);MTT:Sigma產(chǎn)品(貨號:M2128)。
1.3 主要儀器 超凈工作臺(SW-CJ-IF型,蘇州凈化設(shè)備廠);二氧化碳培養(yǎng)箱(3164型,美國Forma scientic公司);倒置顯微鏡(808434型,日本Nikon公司);酶聯(lián)免疫檢測儀(KHB-ST360,上海科華公司)。
1.4 實驗藥物 地龍?zhí)崛∥铮喝〉佚埶幉?0g,10倍水量煎煮提取2次,1h/次,合并提取液,濾過,濃縮至100mL,加入乙醇配制成含乙醇終濃度為50%的藥液,常溫靜置24h,取上清液濃縮至500mg/mL,用飽和NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2~7.4,離心,上清液過0.45μm微孔濾膜除菌,濾液作為貯備液,置冰箱保存?zhèn)溆茫ㄋ盟幬餄舛染陨幜坑嬎悖?/p>
2.1 神經(jīng)母細胞SH-SY5Y傳代培養(yǎng) 倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況,將長滿細胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄掉,用無血清DMEM液洗一遍,加0.25%胰蛋白酶消化,當細胞變成圓形時小心棄去培養(yǎng)瓶中的液體,加適量DMEM完全培養(yǎng)液終止消化,棄去DMEM完全培養(yǎng)液,再加適量DMEM完全培養(yǎng)液并吹打細胞制成細胞懸液,置含5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)。
2.2 MTT比色法 將培養(yǎng)對數(shù)生長期的神經(jīng)母細胞株SH-SY5Y配成單個細胞懸液,調(diào)整懸液濃度并接種到96孔板中,5%CO2、37℃培養(yǎng)24h,分別給予實驗各組含不同濃度地龍?zhí)崛∥锏腄MEM完全培養(yǎng)液,使藥物終濃度分別為 2、5、10、20、30、40、50、80、100 mg/mL,對照組給予等體積的 DMEM完全培養(yǎng)液,每組 8 個復(fù)孔,5%CO2、37℃培養(yǎng) 48h,每孔加20μL 5mg/mL MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4h,終止培養(yǎng),每孔加 150 μL DMSO,振蕩10min,用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測OD值。
地龍?zhí)崛∥镌?~10mg/mL濃度范圍內(nèi),其OD值與正常對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異,P>0.05,表明在此濃度范圍內(nèi)地龍?zhí)崛∥飳ι窠?jīng)母細胞株SH-SY5Y增殖無顯著影響,且藥物濃度在2mg/mL時對其生長有一定的保護作用。當濃度達到20mg/mL以上時,隨著劑量增大OD值逐漸降低,與正常對照組比差別均有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.01,并且抑制率也隨著劑量的增大而增大,表明地龍?zhí)崛∥餄舛冗_到20mg/mL以上時明顯抑制神經(jīng)母細胞株SH-SY5Y的增殖;并且當濃度達100mg/mL時,OD值為0,表明此時100%抑制。見表1。
表1 地龍?zhí)崛∥飳ι窠?jīng)細胞SH-SY5Y細胞增殖的影響 (±S)
表1 地龍?zhí)崛∥飳ι窠?jīng)細胞SH-SY5Y細胞增殖的影響 (±S)
注:與正常對照組比較,*P<0.01。
組別 n OD值 抑制率(%)正常對照組 8 0.5893±0.0481 -地龍?zhí)崛∥铮? mg/mL) 8 0.5980±0.0414 -1.48地龍?zhí)崛∥铮? mg/mL) 8 0.5490±0.0788 6.84地龍?zhí)崛∥铮?0 mg/mL) 8 0.5250±0.0538 10.91地龍?zhí)崛∥铮?0 mg/mL) 8 0.2551±0.0604* 56.71地龍?zhí)崛∥铮?0 mg/mL) 8 0.1966±0.0381* 66.64地龍?zhí)崛∥铮?0 mg/mL) 8 0.1429±0.0336* 75.75地龍?zhí)崛∥铮?0 mg/mL) 8 0.0818±0.0170* 86.12地龍?zhí)崛∥铮?0 mg/mL) 8 0.0180±0.0058* 96.94地龍?zhí)崛∥铮?00 mg/mL)8 0.0000±0.0000* 100.00
地龍為我國傳統(tǒng)中藥,具有較為廣泛的藥理學(xué)作用,中醫(yī)臨床用于治療多種疾病。常規(guī)認為在常用劑量及傳統(tǒng)給藥劑量下本品無毒。但有研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓應(yīng)激分泌液的蛋白組分有劇毒性[4]。因此,應(yīng)用地龍?zhí)崛∥飼r必須選擇合適的劑量,既保證良好的臨床效果,又降低對人體毒性。
MTT法是一種檢測細胞存活和增殖的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚,結(jié)晶的產(chǎn)量與活細胞數(shù)成正相關(guān)。MTT比色法因靈敏度高、操作簡便、經(jīng)濟、快速而被廣泛應(yīng)用。
本文研究結(jié)果顯示,地龍?zhí)崛∥镌?~10mg/mL濃度范圍內(nèi)對神經(jīng)母細胞株SH-SY5Y的存活無明顯抑制作用,而且在2mg/mL時表現(xiàn)出保護作用,這意味著在臨床上小劑量使用地龍?zhí)崛∥飳ι窠?jīng)系統(tǒng)具有康復(fù)保健、預(yù)防疾病發(fā)生的作用,這給地龍保健品的開發(fā)提供了實驗依據(jù)。當濃度達到20mg/mL及以上時,細胞毒性呈跳躍式加強,隨著劑量的增大神經(jīng)細胞的抑制率也增大;當濃度達100mg/mL時,呈現(xiàn)100%抑制。提示:(1)地龍在小劑量使用時,對神經(jīng)細胞體無毒性并且有一定的保護作用,這對預(yù)防腦中風的發(fā)病用藥以及保健藥品的開發(fā)具有指導(dǎo)意義;(2)地龍在大劑量使用時,不僅沒有保護作用,而且對神經(jīng)細胞有抑制生長的毒性作用,提示地龍在臨床上的使用劑量不能過大,以免副作用的發(fā)生。
[1]韓正雪,賴光強,張維,等.地龍水煎劑對血小板聚集的影響[J].中外健康文摘·臨床醫(yī)藥版,2008,5(4):27
[2]馮敏超,康白,毛淑梅,等.地龍耐熱蛋白對自發(fā)性高血壓大鼠心肌血管緊張素Ⅱ水平及血管緊張素Ⅱ-1型受體表達的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007,16(26):3 794-3 796
[3]張德新.五味地龍湯對哮喘豚鼠作用機制的試驗研究[D].武漢:湖北中醫(yī)學(xué)院,2007.78
[4]張租,何俐明,于培爛,等.蚯蚓毒素及其去除方法的初步研究[J].中國生化藥物雜志,2001,22(3):112-113