余宏盛，嚴(yán)耀明，茅奇峰，高基民

(1.溫州醫(yī)學(xué)院 浙江省模式生物技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035；2.深圳第三人民醫(yī)院，廣東 深圳 518020)

hIL-15-SA雙功能融合蛋白的制備

余宏盛1，嚴(yán)耀明2，茅奇峰1，高基民1

(1.溫州醫(yī)學(xué)院 浙江省模式生物技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035；2.深圳第三人民醫(yī)院，廣東 深圳 518020)

目的：對雙功能融合蛋白hIL-15-SA的發(fā)酵及純化工藝進(jìn)行研究。方法：采用發(fā)酵罐高密度發(fā)酵hIL-15-SA工程菌，通過鎳柱親和層析及陰離子交換層析純化目的蛋白。免疫印跡分析產(chǎn)物，淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)以及細(xì)胞錨定試驗(yàn)檢測雙功能融合蛋白hIL-15-SA的生物學(xué)活性。結(jié)果：采用半合成培養(yǎng)基，以3%的接種量，pH值為7.2發(fā)酵可得到濕菌47 g/L，21.15 g/L包涵體。經(jīng)純化后目的蛋白純度為97%。細(xì)胞增殖試驗(yàn)和細(xì)胞表面錨定修飾試驗(yàn)表明，經(jīng)純化復(fù)性的hIL-15-SA融合蛋白具有雙重生物活性。結(jié)論：本研究獲得了高產(chǎn)量、高純度的hIL-15-SA雙功能融合蛋白，為后續(xù)的體內(nèi)生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。

白細(xì)胞介素15；鏈親和素；融合蛋白；中試工藝

利用基因修飾或細(xì)胞表面錨定修飾技術(shù)將具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子修飾腫瘤細(xì)胞制成腫瘤疫苗是目前研究的熱點(diǎn)。白細(xì)胞介素-15（interleukin-15，IL-15)是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，其生物學(xué)效應(yīng)與IL-2相似，能刺激T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞的增殖和分化[1-2]。鏈親和素（streptavidin，SA）是由親和素鏈霉菌產(chǎn)生的非糖基化同源四聚體蛋白。它能與生物素非共價(jià)緊密結(jié)合，由于鏈親和素可與生物素快速且?guī)缀醪豢赡娴某瑥?qiáng)結(jié)合[3]，以及生物素較容易參入各種生物分子（如蛋白質(zhì)，核酸和脂多糖）中，即生物素化，故鏈親和素-生物素間的強(qiáng)力作用可用于生物醫(yī)學(xué)的許多領(lǐng)域[4-5]。我們利用細(xì)胞表面易于生物素化和鏈親和素與生物素間特異高效且超強(qiáng)的結(jié)合這兩個(gè)特性，研制了hIL-15-SA雙功能融合蛋白，通過鏈親和素與表面已生物素化的腫瘤細(xì)胞的高效結(jié)合，將hIL-15錨定在腫瘤細(xì)胞表面，制成hIL-15表面錨定修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗。

本研究在已成功克隆、表達(dá)及實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制備hIL-15-SA雙功能融合蛋白的基礎(chǔ)上，采用發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)，鎳柱親和層析及陰離子交換層析純化，初步研究了hIL-15-SA雙功能融合蛋白的中試制備工藝，并對所制備蛋白進(jìn)行了雙功能的檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌株與試劑：大腸桿菌BL21（DE3）、質(zhì)粒pET21a-hIL15-SA-6His均由本實(shí)驗(yàn)室保存；IPTG、氨芐西林、氯霉素、免疫印跡以及MTT檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所。Ni-NTA、DEAE層析柱及填料購自美國GE公司，低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購自大連Takara。

1.2 方法

1.2.1工程菌的篩選：將質(zhì)粒pET21a-hIL-15-SA轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB平板（含50μg/mL氯霉素，50μg/mL氨芐霉素），挑取單克隆菌落于5 mL LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDSPAGE電泳鑒定，凝膠掃描分析儀分析，取表達(dá)量最高的菌株作為發(fā)酵用菌種。

1.2.2hIL-15-SA工程菌的發(fā)酵：將篩選得到的菌株接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，制備用于發(fā)酵的二級種子，以3%接種量接種于發(fā)酵罐中，采用半合成培養(yǎng)基成分：20 g/L蛋白胨，40 g/L酵母抽提物，3 g/L硫酸鎂，4 g/L磷酸二氫鈉，12 g/L磷酸氫二鈉，5 mL/L甘油。通過0.1 mol/L NH3·H2O和0.1 mol/L HCl控制發(fā)酵過程的pH值在7.2左右，溶氧量30%，通氣量調(diào)至6～8 L/min。在37 ℃，500 r/min條件下發(fā)酵生產(chǎn)，并添加補(bǔ)料培養(yǎng)基1 L（60 g/L蛋白胨，30 g/L酵母抽提物，6 g/L硫酸鎂，4 g/L磷酸二氫鈉，12 g/L磷酸氫二鈉，40 mL/L甘油），0.3 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。整個(gè)發(fā)酵過程持續(xù)11 h（細(xì)菌生長期6 h，誘導(dǎo)期5 h）。

1.2.3hIL-15-SA融合蛋白的純化：10000 r/min，4 min離心集菌，細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L NaCl pH 8.0)重懸菌體，壓力破碎儀破碎細(xì)胞。離心收集包涵體-20 ℃保存?zhèn)溆没蛑苯舆M(jìn)行純化制備。

①鎳柱親和層析：8 M尿素，4 ℃攪拌過夜溶解包涵體，離心取上清并于0.22μm濾器過濾后用平衡液（6 mol/L urea，5 mmol/L β-ME，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.4）稀釋1倍為上柱前樣品。包涵體首先通過Ni-NTA（30 mL，GE公司）親和層析，通過AKTA純化儀（美國GE）控制流速在1 mL/min。分別用0，30和100 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白。洗脫流速2 mL/min。

②DEAE離子交換層析：將經(jīng)過Ni-NTA純化的目的蛋白，進(jìn)行DEAE離子交換層析，平衡液（6 mol/L urea，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.4）平衡3～5倍柱床體積，并分別用0、50、70、200 mmol/L NaCl洗脫液洗脫。SDS-PAGE分析鑒定產(chǎn)物。

1.2.4hIL-15-SA融合蛋白的復(fù)性：將純化的融合蛋白hIL-15-SA進(jìn)行梯度尿素透析復(fù)性，透析液分別為A（4 mol/L urea，0.2 mol/L NaCl，0.2 mmol/L GSSG，1 mmol/L GSH，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.2）；B（2 mol/L urea，0.2 mmol/L GSSG，1 mmol/L GSH，20 mmol/L Tris-HCl，10% glycerine pH 8.2）；C（5% glycerine，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.2）；D（20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.2）和E（PBS），每種透析液透析8 h，每4 h換液一次，復(fù)性后蛋白經(jīng)非還原性SDS-PAGE以及免疫印跡分析鑒定。

1.2.5Western blot：用12% SDS-PAGE電泳，鑒定表達(dá)產(chǎn)物的分子量。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，用含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉2 h。加鼠抗hIL-15一抗4 ℃過夜，用TBST充分清洗3～4次后，加二抗Goat anti-Mouse IgG（1:1000稀釋）孵育1 h，最后，用DAB顯色液作用1～2 min，直至條帶出現(xiàn)。

1.2.6hIL-15-SA雙功能融合蛋白的活性檢測：

①淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)：取小鼠脾臟，分離鼠淋巴細(xì)胞，按每孔1×106/mL細(xì)胞密度100μL接種于96孔板?？瞻捉M為ConA（5μg/mL）刺激的淋巴細(xì)胞。將復(fù)性的hIL-15-SA融合蛋白作倍比稀釋加入培養(yǎng)板中，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔 (以hIL-15標(biāo)準(zhǔn)品作對照)，37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)48 h后MTT法檢測依賴于IL-15的淋巴細(xì)胞增殖情況。

②細(xì)胞表面錨定修飾試驗(yàn)：取生長狀態(tài)良好的RM-1細(xì)胞，酒精滅活調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×106/mL，加入Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin使終濃度為1 mg/mL，室溫作用1 h左右；加入經(jīng)復(fù)性的hIL-15-SA融合蛋白置室溫1 h，PBS洗3次；然后加入鼠抗hIL-15抗體于37 ℃孵育1 h，最后加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠Ig G二抗1μL室溫避光作用30 min，PBS洗3次后，每管取500μL經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.2.7hIL-15-SA融合蛋白的含量測定：參見文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 工程菌發(fā)酵結(jié)果采用發(fā)酵罐，應(yīng)用半合成培養(yǎng)基，以3%的接種量接種種子菌，發(fā)酵過程中pH值控制在7.2左右，溶氧量30%。工程菌活化6h，IPTG誘導(dǎo)5h。發(fā)酵可得到工程菌濕重47 g/L。見表1、圖1。

表1hIL-15-SA融合蛋白的制備過程

圖1SDS-PAGE鑒定融合蛋白hIL15-SA的表達(dá)、純化和復(fù)性

2.2 hIL-15-SA融合蛋白的分離純化包涵體洗滌后經(jīng)過Ni-NTA親和層析，雜蛋白在30 mmol/L咪唑洗脫出，目的蛋白100 mmol/L咪唑濃度下被洗脫，經(jīng)Ni柱純化后，純度達(dá)到65.3%（見表1）。同時(shí)，收集100 mmol/L咪唑洗脫蛋白再經(jīng)DEAE離子交換層析，最終目標(biāo)蛋白在200 mmol/L NaCl濃度下被洗脫，純度達(dá)到97%（見圖1-2）。

圖2免疫印跡鑒定hIL15-SA融合蛋白

2.3 hIL-15-SA雙功能融合蛋白的活性檢測該融合蛋白的生物學(xué)活性包括hIL-15和SA的生物學(xué)活性。經(jīng)ConA刺激后的小鼠脾細(xì)胞，在加入復(fù)性后的不同濃度的hIL-15-SA雙功能融合蛋白后，脾細(xì)胞的增殖與融合蛋白的濃度呈劑量依賴關(guān)系（見圖3）。同時(shí)，用FITC標(biāo)記的二抗，經(jīng)流式細(xì)胞儀對錨定在已生物素化的RM-1前列腺癌細(xì)胞表面的hIL-15-SA融合蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：hIL-15-SA融合蛋白能高效錨定修飾在已生物素化的腫瘤細(xì)胞表面，修飾效率為99%（見圖4）。

圖3MTT法檢測hIL-15-SA的淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)

圖4細(xì)胞錨定率檢測

3 討論

發(fā)酵罐高密度發(fā)酵的目標(biāo)是提高目的蛋白表達(dá)量和工程菌的產(chǎn)量。對于hIL-15-SA工程菌，本研究應(yīng)用半合成培養(yǎng)基，以3%的接種量接種種子菌，發(fā)酵過程中pH值控制在7.2左右，溶氧量30%。發(fā)酵可得到工程菌濕重47 g/L，基本能滿足中試制備的需要。重組hIL-15的純化過程分為三步：第一步是進(jìn)行包涵體的處理以初步純化；第二步是采用鎳柱親和層析純化，蛋白純度達(dá)到65.3%；第三步是根據(jù)DNAStar軟件分析，表明蛋白hIL15-SA的等電點(diǎn)5.42，故選取DEAE離子交換法進(jìn)一步純化，采用陰離子交換層析純化，蛋白的純度達(dá)到97%。由于蛋白質(zhì)本身的復(fù)雜性和多樣性，蛋白質(zhì)的復(fù)性方法也各不相同[7-8]，Ward等[9]通過稀釋復(fù)性法將hIL-15緩慢逐滴地加入復(fù)性液中進(jìn)行復(fù)性，我們通過加入氧化還原對（GSH/GSSG），以增加二硫鍵的正確配對率，從而提高目的蛋白復(fù)性效率。從SDS-PAGE圖中可以看出，經(jīng)復(fù)性后的重組蛋白100 kD左右出現(xiàn)多聚體條帶，同時(shí)，經(jīng)依賴于hIL-15的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)以及細(xì)胞表面錨定修飾試驗(yàn)，驗(yàn)證了本研究制備的hIL-15-SA雙功能融合蛋白具有hIL-15和SA的雙重活性。

總之，本研究在成功表達(dá)hIL-15-SA融合蛋白的基礎(chǔ)上，進(jìn)行中試制備研究，最終獲得了高純度的hIL-15-SA雙功能融合蛋白，為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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（本文編輯：吳健敏）

Preparation of hIL-15-SA fusion protein

YU Hongsheng*，YAN Yaoming，MAO Qifeng，GAO Jimin1. *Zhejiang Provincial Key Laboratory for Model Organisms，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective: To study the fermentation and purification of bifunctional fusion protein hIL-15-SA. Methods:The target protein was orified through the application of affinity chromatography and anion exchange chromatography using high-density fermentation of hIL-15-SA from E.coli. Immunoblotting analysis was used to analyze the hIL-15-SA. Lymphocyte cell proliferation assay and cell-surface-modification assay were performed to analyze the bi-functionalities of the fusion protein. Results:Using the semi synthetic medium，the optimal inoculum size was 3% and pH value was 7.0，47 g/L wet cells and 21.15 g/L inclusion bodies were collected. The purity of target protein reached 97% after purification. Cell proliferation and cell-surface-modification assays demonstrated that the purified and refolded hIL-15-SA fusion protein retained both hIL-15 and streptavidin bioactivities. Conclusion:The work presented an efficient way to prepare hIL-15-SA bifunctional fusion protein with large quantity and good purity， thus will allow us to perform further studies in vivo.

interleukin-15；streptavidin；fusion protein；pilot scale

book=7,ebook=18

Q816

A

1000-2138 (2010)04-0326-04

2010-02-28

浙江省重大科技專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（2008C 14082）；浙江省自然科學(xué)基金杰出青年團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目（R20 80407）；溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（G20090142）。

余宏盛(1983-)，男，湖北咸寧人，碩士生。

高基民，教授，博士生導(dǎo)師，Email：jimingao@ yahoo.com。