劉 茜，黎韋華，黃 冰，李永平，林少春，黃健發(fā)，徐曉平，孫雪榮，陳夢飛，陳系古，廖秀珍

(中山大學(xué)中山眼科中心眼科學(xué)國家重點實驗室，廣州 510060)

研究報告

玻璃體腔注射對裸小鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)的影響

劉 茜，黎韋華，黃 冰，李永平，林少春，黃健發(fā)，徐曉平，孫雪榮，陳夢飛，陳系古，廖秀珍

(中山大學(xué)中山眼科中心眼科學(xué)國家重點實驗室，廣州 510060)

目的 觀察單純的玻璃體腔注射對裸小鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)的影響，為建立簡單的制作視神經(jīng)損傷動物模型奠定實驗基礎(chǔ)。方法在全身麻醉配合眼部局部麻醉情況下，利用微量注射器往裸小鼠玻璃體腔內(nèi)迅速注入10 μL生理鹽水，然后在不同的時間點取注射眼進行固定、切片和 HE染色，觀察視網(wǎng)膜特別是視神經(jīng)節(jié)細胞的變化。結(jié)果正常對照組視網(wǎng)膜層次清晰，各層排列整齊而致密，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞呈單層排列，大小不一，染色質(zhì)分布均勻。實驗組于注射后第1天、第3天和第5天視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞減少的情況不明顯，十層結(jié)構(gòu)仍相對清晰。但于第7天，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞出現(xiàn)細胞明顯缺失的現(xiàn)象，第14天為最嚴重，第30天和第60天與第14天相比無明顯差別。結(jié)論玻璃體腔注射過量的生理鹽水能夠損傷視網(wǎng)膜組織，造成神經(jīng)節(jié)細胞減少，有可能成為一種簡單的制作視神經(jīng)損傷動物模型的方法。

視神經(jīng)損傷;裸小鼠;模型，動物;玻璃體腔注射

視網(wǎng)膜組織是視神經(jīng)的一部分，屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。視神經(jīng)損傷多并發(fā)于顱腦損傷，亦可由于各種疾病如青光眼、炎癥、眼外傷、局部缺血和腫瘤壓迫等引起，嚴重者最終可導(dǎo)致失明。其發(fā)生的機制是由于視神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell，RGCs)的凋亡，從而導(dǎo)致視功能的減退和一系列的視功能障礙。加強對視神經(jīng)損傷發(fā)病機制和病理變化的研究，有助于了解和明確損傷視神經(jīng)的再生、修復(fù)情況。而這又必須要有良好的視神經(jīng)損傷動物模型作為基礎(chǔ)?，F(xiàn)有報道的制作這類動物模型的方法都比較耗時耗力。為此，本研究小組根據(jù)以往的實驗經(jīng)驗，采取玻璃體腔注射過量生理鹽水的方法，造成裸小鼠短暫性急性高眼壓，觀察視網(wǎng)膜組織在這種情況下?lián)p傷的情況。為建立一種簡單易行的制作視神經(jīng)損傷動物模型的方法奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、試劑與儀器

SPF級裸小鼠48只，周齡4～6周，體重16～21 g;由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供［SCXK (粵)2008－0020，粵鑒證字2008A004］;中山眼科中心眼科學(xué)實驗動物中心SPF級動物實驗室飼養(yǎng)，晝夜比 12 h:12 h，溫度 23℃ ～25℃，濕度 50% ～60%。手術(shù)及飼養(yǎng)過程符合中山眼科中心動物倫理委員會要求。

混合固定液:福爾馬林200 mL、冰醋酸100 mL 95%、酒精1000 mL、蒸餾水700 mL(廣州化學(xué)試劑廠)。4.3%水合氯醛(中山眼科中心藥劑科)，利多卡因滴眼液(上海禾豐制藥有限公司)，微量注射器(100 μL)(生工生物工程有限公司)，普通熒光顯微鏡(德國Zeiss公司)。

1.2 動物分組

將動物分正常組和實驗組。實驗組又按照時間點(注射后第1，3，5，7，14，30，60天)分為7個亞組。正常組為未作任何處理裸小鼠。動物隨機分配，每組6只動物。

1.3 動物模型的制作

裸小鼠按430 mg/kg腹腔注射4.3%水合氯醛，麻醉成功后用妥布霉素眼藥水行雙眼抗菌滴藥，10 min后用利多卡因眼藥水行注射眼局部麻醉，然后將裸小鼠固定在體式顯微鏡下。用眼科鑷掙開眼瞼，充分暴露眼球，用微量注射器由角鞏膜緣15°斜向下進針入玻璃體腔，快速注射入10 μL生理鹽水。進針時注意避開晶體。退針時要快速準確，注意不要損傷周圍組織。行單眼注射。注射完畢，若眼球能明顯脹大鼓起，即判斷為造模成功，入選為實驗觀察用;若注射完畢，眼球萎縮，即判斷為造模失敗，淘汰，不用于實驗觀察。玻璃體腔注射后三天內(nèi)滴用妥布霉素眼藥水，一天三次，防止炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

1.4 標本制作

于玻璃體腔注射后第1、3、5、7、14、30和60天取注射側(cè)眼球;取出后在角膜上打一小孔，然后用混合固定液固定2 h，再用4%多聚甲醛4℃固定24 h;這時視網(wǎng)膜基本固定好，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，沿矢狀線方向全層切片眼球，片厚4 μm，HE染色。

1.5 HE染色及神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)

切片常規(guī)HE染色，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜的形態(tài)學(xué)變化。采用單盲法進行視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的計數(shù)。計數(shù)每個400倍光鏡視野中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的個數(shù)，取5個視野，計算平均視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)。采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件作方差分析檢驗。根據(jù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量的變化定量視神經(jīng)節(jié)細胞損傷程度。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜HE染色形態(tài)學(xué)觀察(圖1見彩插4)

正常對照組視網(wǎng)膜層次清晰，各層排列整齊而致密，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞呈單層排列，大小不一，輪廓不規(guī)則，細胞核大小不一，染色質(zhì)分布均勻。從核形態(tài)學(xué)上可明確分為兩類:一類大而淺染，胞核有時可見核仁;另一類小而深染?？梢娚倭砍市略滦蔚难軆?nèi)皮細胞分布于毛細血管內(nèi)表面(圖1A)。注射后第1、3和5天視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞缺失并不明顯，視網(wǎng)膜組織層次相對清晰(圖1B，C，D)。注射后7 d視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞出現(xiàn)缺失現(xiàn)象(圖1E)。14 d時最明顯，細胞核大而淺染，胞核明顯稀疏，大而淺染的細胞核明顯減少，甚至消失，小而深染的細胞核相對減少較輕，內(nèi)、外核層細胞變化不明顯 (圖1F)。注射后第30和60天時視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞缺失速度減慢，損傷情況與 14 d相似(圖1G，H)。

2.2 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目的變化與形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果相一致。實驗組與正常對照組比較，注射后1 d、3 d、5 d和 7 d神經(jīng)節(jié)細胞減少不明顯(P＞0.05)，注射后14 d、30 d和60 d神經(jīng)節(jié)細胞顯著減少(P＜0.01);另外，統(tǒng)計學(xué)分析得出第1、3、5天相鄰兩組間差異不顯著(P＞0.05);注射后第7、14、30、60天各組間也無顯著性差異(P＞0.05)(表1)。

表1 不同時間點視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)計數(shù)(±s)Tab.1 Retinal ganglion cell(RGCs)number counting at different time intervals(±s)

表1 不同時間點視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)計數(shù)(±s)Tab.1 Retinal ganglion cell(RGCs)number counting at different time intervals(±s)

注:*:顯著性差異(P＜0.05)。Note:*:Significant difference(P＜0.05).

組別 正常組1d 3d 5d 7d 14d 30 d 60 d Groups Normal 1d 3d 5d 7d 14d 30d 60 d 41.50±4.95 36.50±0.70 39.67±2.31 37.33±9.07 25.75±11.87*16.50±3.42*20.33±5.51*18.25±5.32*

3 討論

如何預(yù)防致盲性眼病的發(fā)生發(fā)展，如何提高患者的視力，成為當前研究的熱點。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷提高和診療手段的不斷進步，感染性眼病和白內(nèi)障等致盲性疾病得到了有效診治。但是同時由于生活水平的提高及生活壓力的不斷加大，青光眼、高眼壓性疾病也不斷增加。這些疾病都可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷并最終致盲。目前這些疾病尚無有效的治療方法。

3.1 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷模型

隨著時代的進步和科學(xué)研究的發(fā)展，視神經(jīng)保護和損傷修復(fù)成為眼科學(xué)和神經(jīng)科學(xué)的研究熱點。為了對視神經(jīng)的損傷機制及神經(jīng)保護方法進行研究，學(xué)者們建立了不同的動物模型。目前視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷的動物模型，主要有高眼壓動物模型和視神經(jīng)損傷模型。青光眼是致盲性眼病的一種，其最終結(jié)果是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞死亡，視神經(jīng)發(fā)生進行性損害，從而導(dǎo)致不可逆性視力喪失［1］。青光眼動物模型分為兩大類:一類為非高眼壓的視神經(jīng)損傷模型，另一類為高眼壓模型。非高眼壓的視神經(jīng)損傷模型主要又分為缺血再灌注模型、機械損傷模型和藥物毒物損傷模型［2－4］。高眼壓損傷模型主要分為急性高眼壓模型和慢性高眼壓模型。曾有研究者將生理鹽水注入大鼠前房，引發(fā)急性高眼壓導(dǎo)致血液供應(yīng)中斷，繼而引發(fā) RGCs的死亡［5］。該實驗雖然簡單易行，但是對于小鼠來說，其前房注射難度較高，故該模型的應(yīng)用也受到限制。Morrison等［6］將高滲鹽水注入 Brown Norway大鼠鞏膜上靜脈，導(dǎo)致小梁網(wǎng)硬化，繼而導(dǎo)致持續(xù)性眼壓升高，引起視神經(jīng)損害。此方法制作動物模型的缺點是操作較復(fù)雜，需要注射高滲鹽水用的特殊精細管，且需重復(fù)注射。Ueda等［7］用印度藍注入前房，碳離子堆積在前房角形成一黑色條帶，在不需要前房角鏡的情況下，可以黑色條帶為標記激光光凝小梁網(wǎng)，導(dǎo)致眼壓升高維持了4周。組織學(xué)切片也證實形成了周邊虹膜前粘連，成功制作了高眼壓動物模型。但激光光凝小梁網(wǎng)法的缺點是需多次激光光凝才能獲得60%的成功率。神經(jīng)元軸突的損傷，會導(dǎo)致軸漿運輸?shù)恼系K，最終致神經(jīng)元的凋亡和壞死。視神經(jīng)的損傷也必然影響視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的功能，并可能跨神經(jīng)元影響到視覺信號傳導(dǎo)通路的視網(wǎng)膜各層，并引起視網(wǎng)膜功能和結(jié)構(gòu)的改變。視神經(jīng)結(jié)扎和夾傷模型是目前臨床常見的視神經(jīng)鈍挫傷的實驗?zāi)Ｐ?。國外有實驗采?0－0縫線于球后1.0 mm處結(jié)扎視神經(jīng)軸突的方法建立 RGCs損傷模型的報道［8，9］。另有實驗用壓力恒定的反向鑷于球后2 mm處夾持視神經(jīng)建立視神經(jīng)損傷的動物模型［10］。同時有實驗運用視神經(jīng)損傷模型，研究視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的變化情況，并定量分析［10］。其研究結(jié)果表明，視神經(jīng)不全損傷導(dǎo)致了視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，傷后7天神經(jīng)節(jié)細胞明顯丟失，28 d視網(wǎng)膜出現(xiàn)了萎縮，厚度變薄。但視神經(jīng)損傷常常需要暴露視神經(jīng)鞘膜，因此，不可避免的增加了對視神經(jīng)的牽拉和對眼球后極部血管的損傷，使得 RGCs損傷因素變得復(fù)雜。同時，也有研究運用RNA干擾技術(shù)，干擾酪氨酸酶，為體內(nèi)酪氨酸缺失所致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的損傷模型奠定了基礎(chǔ)［11］。

綜上所述，為了方便青光眼等因素所引發(fā)的視神經(jīng)損傷性疾病的發(fā)病機制及治療方法的研究，有必要建立一種簡單，可重復(fù)的方法制作動物模型。另外，由于裸小鼠免疫學(xué)方面特點，其視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷模型，能夠為異種細胞移植的體內(nèi)實驗奠定基礎(chǔ)，其眼部所需細胞治療量亦較大鼠模型少。鑒于以上的研究目的和裸小鼠動物模型的應(yīng)用潛力，本實驗采用玻璃體腔瞬間注射大量生理鹽水，于注射后第1、3、5、7、14、30、60天觀察其視網(wǎng)膜組織和神經(jīng)節(jié)細胞受損傷的情況，探討簡單的玻璃體腔注射制作裸小鼠視神經(jīng)損傷模型的可行性。本實驗結(jié)果提示該方法是具有可能性的。

研究過程中發(fā)現(xiàn)，當注入5 μL生理鹽水時，小鼠的玻璃體腔腫脹的并不十分明顯，當注入10 μL時，玻璃體腫脹明顯，眼球鼓出眼眶，并可維持一段時間。同時，由于有文獻指出，大鼠對側(cè)未損傷的視網(wǎng)膜也會有膠質(zhì)反應(yīng)［12，13］，因此不選擇對側(cè)作為對照組，而以未處理的裸小鼠作為對照。本實驗發(fā)現(xiàn)注射生理鹽水后5 d內(nèi)，RGCs數(shù)目幾乎保持不變，第7天時開始出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的缺失。注射后7～14 d是RGCs快速減少期，并在第14天時達到高峰。之后的改變?nèi)匀怀鴲夯姆较虬l(fā)展，但是速度有所減慢并與14 d差異不大。

3.2 RGCs缺失與注射經(jīng)過時間的關(guān)系

本實驗通過玻璃體腔注射過量生理鹽水后2個月內(nèi)多個時間點的RGCs形態(tài)學(xué)、定量觀察，發(fā)現(xiàn)玻璃體腔注射后，盡管各時間點 RGCs下降幅度存在明顯差異，但是他們的大體變化趨勢是一致的。在注射后早期(1～5 d)，RGCs變化不明顯，注射后7 d時RGCs出現(xiàn)缺失;注射后中期(7～14 d)RGCs急劇大量缺失，為快速缺失期;損傷后期(30～60 d) RGCs缺失速度減慢，開始進入平穩(wěn)減速期。由本文的實驗結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)節(jié)細胞的缺失與注射后所致?lián)p傷的時間之間有一定的相關(guān)性，兩者之間變化有一定的規(guī)律。

本實驗通過玻璃體腔注射過量生理鹽水入裸小鼠眼內(nèi)，并定量分析了該方法對裸小鼠視網(wǎng)膜組織的影響及RGCs缺失程度與時間的相關(guān)性。該方法簡單、易行，能夠?qū)е乱暰W(wǎng)膜的損傷、神經(jīng)節(jié)細胞的缺失。另外，由于裸小鼠具有 T淋巴細胞免疫缺陷的特點，制作的動物模型更方便異體細胞的體內(nèi)移植研究。本實驗為急性高眼壓所致的視神經(jīng)節(jié)細胞損傷分子機制及視神經(jīng)保護性治療的深入研究提供了實驗基礎(chǔ)。

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The Impact of Intravitreal Injection on the Retina Morphology in Nude Mouse

LIU Qian，LI Wei－h(huán)ua，HUANG Bing，LI Yong－ping，LIN Shao－chun，HUANG Jian－fa，XU Xiao－ping，SUN Xue－rong，CHEN Meng－fei，CHEN Xi－gu，LIAO Xiu－zhen
(State Key Laboratory of Ophthalmology，Zhongshan Ophthalmic Center，Sun Yat－sen University，Guangzhou 510060，China)

ObjectiveTo observe the impact of intravitreal injection on the retina morphology in nude mouse and to provide the experimental basis for the establishment of optic nerve injury animal model。MethodsUnder general anesthesia combined with optic local anesthesia，10 μL normal saline was quickly injected into the vitreous chamber with micro－syringe，resulting in short－term acute high intraocular pressure.Then the injected eyeballs were sampled，fixed，sliced and HE stained at different time points.Then，the morphological changes of the retina，ganglion cells in particular were observed。ResultsThe normal retinal cells presented clear layers and each layer was arranged regularly and tightly. The ganglion cells were arranged in monolayer pattern and had different sizes from each other，and the chromatin was distributed evenly.After intravitreal injection，the retinal ganglion cells were not significantly decreased at the first，the third and the fifth day.The ten layers of retina were still relatively clear.However，on the seventh day，the retinal ganglion cells lay showed marked cell loss，which was most serious on the fourteenth day.After that day the decreasing speed was decreased.The thirtieth and sixtieth days were not significantly different from the fourteenth day。Conclusions Intravitreal injection of overdose normal saline is likely to induce short－term acute high intraocular pressure and damage the retinaltissue，resulting in the reduction of ganglion cells.It is expected to become a simple method to establish the animal model of optic nerve injury.

Optic nerve damage;Nude mouse;Model，animal;Intravitreal injection

Q95－33

A

1671－7856(2010)07－0032－04

2010－03－02

廣東省科技計劃項目(2008A060202008)。

［基金項目］劉茜(1982—)，女，碩士，研究方向:視神經(jīng)保護。E－mail:jiuer790@yahoo.com.cn

黃冰，副研究員。E－mail:huangbing2000@hotmail.com