李 挺，張麗芳，劉 星，劉先菊，劉江寧，李萬波，林樹柱

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

研究報(bào)告

肺炎克雷伯氏菌特異性抗原的篩選與鑒定

李 挺，張麗芳，劉 星，劉先菊，劉江寧，李萬波，林樹柱

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的 尋找肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)血清學(xué)檢測用特異性抗原。方法雙向電泳分離K.pneumoniae總蛋白，通過免疫印跡(Western blotting)與常見病原菌的多抗反應(yīng)篩選特異性抗原蛋白，原核表達(dá)該蛋白并用ELISA法驗(yàn)證。結(jié)果獲得K.pneumoniae的雙向電泳圖譜。尋找Western blotting中與K.pneumoniae自身多抗反應(yīng)而不與與其它病原菌多抗反應(yīng)的蛋白，質(zhì)譜鑒定為酸性磷酸酶(Acid phosphatase，GI:238894261)。經(jīng)表達(dá)純化并以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)驗(yàn)證，證明該蛋白作為包被抗原的靈敏度高，特異性強(qiáng)。結(jié)論K.pneumoniae酸性磷酸酶是適用于該菌感染檢測特異性抗原蛋白。

小鼠;檢測;特異性抗原;雙向電泳;免疫印跡;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)是人和動物呼吸道和腸道內(nèi)寄生性條件致病菌，能致動物肺炎及其他化膿性炎癥［1］，實(shí)驗(yàn)動物如果隱性感染，會在行為學(xué)，生長率，相關(guān)器官重量和免疫應(yīng)答方面影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果［2］。我國的實(shí)驗(yàn)動物國家標(biāo)準(zhǔn)［3］把此菌列為無特定病原體(SPF)大小鼠必須檢測及排除的項(xiàng)目。

目前對K.pneumoniae的檢測方法主要是分離培養(yǎng)法，但該方法存在靈敏度低，容易污染環(huán)境造成人和動物感染的缺點(diǎn)。PCR法雖然靈敏度較高，但也需要樣品中存在K.pneumoniae的菌體或DNA［4］，對于處于感染恢復(fù)期的人或動物無法檢出。基于血清學(xué)的免疫檢測方法簡單有效，靈敏度高，特異性好［5］，不需要樣本中存在菌體。但由于K.pneumoniae和其他腸桿菌科存在共同抗原，使傳統(tǒng)的基于全菌抗原的檢測方法準(zhǔn)確度不高。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，尋找并利用細(xì)菌的特異性抗原蛋白建立的檢測方法已成為可能并已有相關(guān)報(bào)道［4］。鑒于K.pneumoniae的檢測在實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量控制上的重要意義，本研究通過免疫印跡技術(shù)篩選出與K.pneumoniae血清強(qiáng)烈反應(yīng)而不與其他抗血清反應(yīng)的蛋白，用質(zhì)譜鑒定，原核表達(dá)和ELISA法驗(yàn)證，獲得用于K.pneumoniae血清學(xué)檢驗(yàn)的表達(dá)抗原蛋白。

1 材料和方法

1.1 材料

病原細(xì)菌來自于中國藥品生物制品檢定所中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，本所保藏。BL21(DE3)大腸桿菌(Escherichia coli)菌株，pET28a載體購于Novagen，由本所遺傳中心保藏。SPF級ICR小鼠購于維通利華公司［SCXK(京)2006－0009］，飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)籠具(IVC)中。等電聚焦電泳系統(tǒng)購于Invitrogen，垂直電泳槽與半干式電轉(zhuǎn)移槽購于ATTO，高速冷凍離心機(jī)購于Beckman。細(xì)菌培養(yǎng)基均來自英國Oxoid，弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均為Sigma原裝，BCA蛋白定量試劑盒購于北京博奧森，固相pH梯度(IPG)等電聚焦電泳預(yù)制膠條購于Invitrogen，蛋白 Marker購于 MBI，聚偏氟乙烯膜(PVDF)購于美國PALL，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG(H+L)(二抗)來自美國Jackson，DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物，Ni－NTA樹脂購于Novagen，其他生化試劑均為進(jìn)口分裝。

1.2 病原菌的培養(yǎng)

嗜肺巴氏桿菌(Pasteurella pneumotropica)，鼠棒狀桿菌(Corynebacterium kutscheri)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)， 念 珠 狀 鏈 桿 菌(Streptobacillus moniliformis)， 肺 炎 鏈 球 菌(Streptococcus pneumuniae)培養(yǎng)于含5%馬血清(經(jīng)56℃30 min滅活補(bǔ)體)的胰胨大豆肉湯(TSB)，K.pneumoniae，大腸桿菌，綠膿桿菌 (Pseudomonasaeruginosa)，腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)，假結(jié)核耶爾森菌(Yersinia pseudotuberculosis)培養(yǎng)于TSB，在搖床中以37℃ 180 r/min培養(yǎng)12～48 h至對數(shù)末期。

1.3 各種病原菌多抗血清的制備

收集各種病原菌的培養(yǎng)液，分別以6000 r/mim 4℃離心10 min，棄上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)重懸洗滌菌體三次，BCA法定量總蛋白，再加入甲醛至終濃度0.2%，4℃ 72 h滅活菌體。待取少量處理液涂血平皿驗(yàn)證無活菌存在后，離心收集菌體用PBS洗滌重懸并按照報(bào)道的方法，免疫小鼠制備多克隆抗體［6］，每種抗原免疫10只小鼠，每只小鼠按首次免疫50 μg總蛋白與弗氏完全佐劑混合乳化;第4周、第6周以25 μg總蛋白與弗氏不完全佐劑混合加強(qiáng)免疫，第8周以100 μg總蛋白不加佐劑沖擊免疫的方案進(jìn)行免疫。沖擊免疫7 d后處死小鼠取血。以各種病原體全菌包被 ELISA板檢測血清的效價(jià)，效價(jià)高于 1∶10 000的血清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 雙向電泳樣品的制備

K.pneumoniae培養(yǎng)液以 6000 r/mim 4℃離心10 min，棄上清，菌體用含 250 mmol/L蔗糖的 TE (10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，pH 8.0)緩沖液洗滌三次，后用4倍體積的 TE重懸，在冰上用超聲波以15 s為間歇破碎細(xì)胞至鏡檢無完整菌體，20 000 r/mim 4℃離心15 min，上清即為可溶性組分;沉淀用TE洗滌后離心并用4倍體積的 TE重懸，收集不溶性組分。兩組分分別用BCA法測蛋白濃度。

1.5 雙向電泳

等點(diǎn)聚焦電泳(IEF)采用 Gorg等［7］報(bào)道的方法，使用 pH(4～7)的 IPG預(yù)制膠條運(yùn)行于 Zoom IPG Runner系統(tǒng)?？扇芘c不溶性蛋白組分分別溶解于水化液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2.5% CHAPS，1%DTT，0.5%pH(3～10)兩性電解質(zhì)，痕量溴酚藍(lán))，每膠條上樣 70 μg蛋白，25℃水化2 h。IEF條件為200 V 20 min，450 V 15 min，750 V 15 min，2000 V 30 min，3000 V 10 min。膠條先后置于含2%DTT和2.5% 碘代乙酰胺的平衡液(6 mol/L尿素，30%甘油，2%SDS，50 mmol/L Tris-HCl，pH8.8，痕量溴酚藍(lán))平衡15 min，之后轉(zhuǎn)入10%的聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠采用Laemmli系統(tǒng)［8］進(jìn)行第二向SDS-PAGE分離。電泳完后使用膠體考馬斯亮藍(lán) G250染色法［9］染色。電泳結(jié)果用Imagemaster 2DTM軟件分析。感興趣的蛋白切膠做膠內(nèi)胰酶酶切與激光輔助基質(zhì)解離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析。得到的多肽指紋圖譜(PMF)使用Mascot數(shù)據(jù)庫檢索。

1.6 Western blotting

免疫印跡采用Mansfiled［10］報(bào)道的方法，蛋白以2 mA/cm2恒流1 h轉(zhuǎn)移至預(yù)處理過的 PVDF膜。轉(zhuǎn)移完成后用含 5%脫脂奶粉的 PBST(pH 7.4 PBS，0.05% Tween 20)封閉 1 h。膜分別與K. pneumoniae抗血清(1∶1000稀釋)和其他病原菌抗血清的混合物(每種終稀釋度1∶1000)反應(yīng)。然后用PBST洗膜三次，二抗(1∶2000稀釋)室溫反應(yīng)1 h，再用PBST洗膜三次后用 DAB顯色，待蛋白點(diǎn)清晰后用蒸餾水終止反應(yīng)。

1.7 蛋白的表達(dá)與純化

根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果設(shè)計(jì)引物 (表 1)，以K. pneumoniae基因組為模板擴(kuò)增對應(yīng)蛋白的編碼序列，產(chǎn)物經(jīng)Nco I，Xho I雙酶切純化后連接 pET28a載體，轉(zhuǎn)入 BL21(DE3)菌株，25℃誘導(dǎo)表達(dá)過夜。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA樹脂柱純化后，用PBS 4℃透析過夜。產(chǎn)物用BCA法測定蛋白濃度。

1.8 ELISA

純化后的蛋白用包被緩沖液(15 mmol/L Na2CO3，35 mmol/L NaHCO3，pH 9.6)稀釋至20 μg /mL后4℃過夜包被96孔ELISA板，每孔上樣100 μL。用 PBST洗板之后用封閉液(含1%BSA的PBST)37℃封閉1 h。隨機(jī)各取6份各病原菌的多抗血清用封閉液1∶2 000稀釋后每孔上樣100 μL (陰性血清為1∶40稀釋)37℃反應(yīng)1 h后用PBST洗板，然后用1∶20 000稀釋的二抗37℃孵育1 h，再用PBST洗滌。各反應(yīng)孔中加入100 μL TMB顯色液37℃反應(yīng)10 min后以等體積2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀450 nm，630 nm雙波長讀取吸光度值。結(jié)果用EXCEL軟件計(jì)算均值與標(biāo)準(zhǔn)差并作圖分析。

表1 蛋白質(zhì)譜結(jié)果及引物設(shè)計(jì)Tab.1 Result of protein MS and primer design

2 結(jié)果

2.1 K.pneumoniae總蛋白的分離

為篩選和鑒定K.pneumoniae的特異性抗原，K.pneumoniae總蛋白做雙向電泳分離，經(jīng)膠體考馬斯亮藍(lán)G250染色后用Imagemaster 2DTM分析，可溶性組分共識別出264個點(diǎn)(圖1 A)，不溶性組分共識別出135個點(diǎn)(圖1 B)。這些蛋白質(zhì)大小集中在25 ×103～100 ×103之間，可溶性蛋白的等電點(diǎn)(pI)集中在5～7之間，不溶性蛋白pI在4.5～6.5之間比較集中。雙線電泳的結(jié)果將應(yīng)用于特異性蛋白的篩選和鑒定。

2.2 特異性蛋白的篩選

圖1 K.pneumoniae的雙向電泳Fig.1 2DE map of K.pneumoniae

為了鑒定K.pneumoniae特異蛋白，雙向電泳分離的蛋白分別與K.pneumoniae的多抗血清和其他病原菌抗血清的混合物進(jìn)行免疫印跡，以尋找與自身多抗反應(yīng)，與其他抗血清不反應(yīng)的特異性抗原蛋白。K.pneumoniae裂解液可溶性蛋白中大多數(shù)都與其他細(xì)菌存在交叉反應(yīng)，但仍然能找到部分蛋白僅和K.pneumoniae的抗血清反應(yīng)而不和其他抗血清發(fā)生反應(yīng)(點(diǎn)1～3，圖2)，不溶性組分由于電泳過程中拖尾難以避免，而 Western blotting的靈敏度高于考馬斯亮藍(lán)染色，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)較多豎紋，掩蓋了部分陽性結(jié)果，僅確定一個特異性較強(qiáng)的蛋白(點(diǎn)4，圖2)。

圖2 K.pneumoniae與其自身多抗及與其他病原菌的多抗的Western blooting結(jié)果Fig.2 Western blotting analysis of K.pneumoniae react to its own antiserum and to the antiserum mixture of other pathogens

2.3 特異性抗原的鑒定

Western blotting篩選出的特異性最強(qiáng)靈敏度最高的蛋白(蛋白 1)通過切膠回收，胰酶酶切和MALDI-TOF獲得該蛋白的多肽指紋圖譜。質(zhì)譜結(jié)果用 Mascot數(shù)據(jù)庫(http://www.matrixscience. com)檢索，返回結(jié)果顯示該蛋白為K.pneumoniae的酸性磷酸酶蛋白(表1)。

2.4 特異性抗原的表達(dá)與驗(yàn)證

使用表1中設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增該蛋白的編碼序列，通過Nco I與Xho I酶切位點(diǎn)與pET28a載體連接，使表達(dá)蛋白 C端帶有 his-tag。鎳柱純化后以SDS-PAGE驗(yàn)證，該蛋白純化后純度大于90%。

計(jì)算表達(dá)純化的 Acid phosphatase(酸性磷酸酶)與各種病原菌多抗血清反應(yīng)、顯色的A值的均值與標(biāo)準(zhǔn)差并作圖(圖3)。結(jié)果顯示，該蛋白與K.pneumoniae多抗的反應(yīng)的A值相對于其他多抗差異都顯著，感染血清反應(yīng)A值大于陰性對照的2.1倍。

3 討論

肺炎克雷伯氏菌是實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量檢測中常被檢出的病原菌［11］。當(dāng)前的檢測手段為分離培養(yǎng)法和PCR法。分離培養(yǎng)法耗時(shí)長(2～3 d)，靈敏度低，需要對病原菌進(jìn)行培養(yǎng);基于抗體的雙抗夾心ELISA法［12］和 PCR法靈敏度高但也需要樣品中存在菌體或DNA。傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測法受到交叉反應(yīng)的干擾嚴(yán)重而限制了它的使用。使用表達(dá)的特異性抗原來檢測感染狀況，具有成本低，靈敏度高，耗時(shí)短(2～3 h)步驟少，感染后3～7 d即可檢出，即使感染后恢復(fù)時(shí)細(xì)菌量很少時(shí)也能檢出［4］。該方法已用于部分細(xì)菌的臨床檢驗(yàn)，而尚未見用于動物檢測。人接觸到多種病原菌，臨床檢測試劑都采用大量的陰性血清排除交叉反應(yīng)。而動物一般飼養(yǎng)于相對清潔的環(huán)境下，可接觸病原菌很少，陰性血清不足以排除交叉反應(yīng)，因此本試驗(yàn)采用甲醛滅活的細(xì)菌菌體制備多抗進(jìn)行優(yōu)勢抗原的篩選和交叉抗原的排除;甲醛是蛋白質(zhì)交聯(lián)劑［13］，在滅活細(xì)菌的情況下，能夠穩(wěn)固菌體蛋白的天然構(gòu)象，盡可能使產(chǎn)生的抗體與自然感染相近，采用了小鼠常見的12種病原菌的多抗來排除交叉反應(yīng)，保證了目標(biāo)抗原的特異性。

為準(zhǔn)確得到抗原蛋白，使用IPG-DALT系統(tǒng)做雙向電泳分離細(xì)菌的總蛋白。該系統(tǒng)已被之前的研究證明重復(fù)性好［7］，可在多塊膠上獲得同樣的圖譜用于Western blotting比對。參考以前的雙向電泳結(jié)果［14］，菌體蛋白的 pI主要集中在 4～7的范圍內(nèi)，因此利用了溶解度預(yù)分離和pH(4～7)的窄范圍預(yù)制膠以提高分辨率。之前有報(bào)道用其他方法獲得細(xì)菌的特異性抗原［15］，該方法得到的抗原常為多種成分的混合物，成分不明確，對操作者技術(shù)要求高。本研究根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果設(shè)計(jì)引物表達(dá)帶有 histag的抗原蛋白鎳柱純化，可以低成本獲得大量高純度的抗原蛋白，適合生產(chǎn)并建立標(biāo)準(zhǔn)。

表達(dá) 蛋 白經(jīng) ELISA 驗(yàn) 證，該 蛋 白 與 K. pneumoniae血清反應(yīng)的A值明顯高于與其他血清反應(yīng)的A值，但與大腸桿菌，沙門氏菌和腸炎耶爾森菌存在一定的交叉反應(yīng)，在實(shí)際應(yīng)用中有可能出現(xiàn)難以區(qū)分的情況;這種問題在獲得了所有常見病原菌的特異性抗原建立整合的試劑盒后得到解決。該酸性磷酸酶為K.pneumoniae的功能蛋白，被認(rèn)為是該菌的毒力因子之一［16］，也佐證了該蛋白成為K.pneumoniae特異性抗原的可信性和在不同菌株中存在的穩(wěn)定性。由于病原樣本條件的限制，僅使用了來自于北京的實(shí)驗(yàn)小鼠K.pneumoniae感染血清作為驗(yàn)證。是否對K.pneumoniae所有菌株的檢測都可靠，還需要在實(shí)際檢測應(yīng)用中應(yīng)用大量不同來演的樣本證實(shí)。K.pneumoniae的該酸性磷酸酶蛋白有望成為實(shí)驗(yàn)動物肺炎克雷伯氏菌血清學(xué)檢測的標(biāo)準(zhǔn)抗原。

(本研究成果已申請專利，專利號:ZL201010 105060.1。本研究蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定部分由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)分析中心協(xié)助完成，感謝該中心薛燕，劉炳玉老師給予的技術(shù)指導(dǎo)和幫助。)

圖3 K.pneumoniae酸性磷酸酶與各病原菌抗血清反應(yīng)情況Fig.3 Acid phosphatase reacts to pAbs of each pathogenic bacteria

［1］ 周正任，李凡，葉嗣穎，等.醫(yī)學(xué)微生物學(xué) (第6版)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003:207－208.

［2］ Matsuda Y.Recent trends in the number of laboratory animals used in Japan［J］.ATLA，2004，32(Supplement 1A):299－301.

［3］ 賀爭鳴，田克恭，李紅，等.中國人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn):實(shí)驗(yàn)動物 微生物學(xué)等級及監(jiān)測.GB14922.2－2001［S］.國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，2001.

［4］ McCoola TL，Hoeya JG，Montileone F，el al.Discovery and analysisofBartonella henselaeantigensforuse in clinical serologic assays［J］.Diagn Micr Infec Dis，2008，60:17－23.

［5］ Gosling JP.Immunoassays:a practical approach［M］.Oxford: Oxford University Press，2000:5－6，165－180.

［6］ Howard GC，Kaser MR.Making and using antibodies［M］. Boca Raton:CRC Press，2007:55－61.

［7］ Gorg A，Obermaier C，Boguth G，et al.The current state of twodimensional electrophoresis with immobilized pH gradients［J］. Electrophoresis，2000，21:1037－1053.

［8］ Laemmli UK. Cleavage ofstrcucturalpeoteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.Nature，1970，227:680－685.

［9］ Candiano G，Bruschi1 M.Blue silver:A very sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteome analysis ［J］. Electrophoresis，2004，25:1327－1333.

［10］ Mansfield MA. Rapid immunodetection on polyvinylidene fluoride membrane blots without blocking［J］.Anal Biochem，1995，229:140－143.

［11］ Pritchett-Corning KR，Cosentino J，Clifford CB.Contemporary prevalence of infectious agents in laboratory mice and rats［J］. Lab Animal，2008，11:1－9.

［12］ 何靜云，李紅.分子文庫技術(shù)在感染性疾病血清學(xué)診斷試劑研究中的應(yīng)用［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2005，15(3):179－181.

［13］ Golernis E.Protein-protein interactions:a molecular cloning manual［M］.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2002:286－287.

［14］ Simpson RJ.Purification proteins for proteomics:a laboratory manual［M］.Newwork:Cold Spring Harbor Laboratory Press，2004:433－441.

［15］ 張麗芳，劉星，李紅.嗜肺巴氏桿菌外膜蛋白和脂多糖抗原在血清學(xué)診斷中的意義［J］.中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)，2003，11 (4):226－229.

［16］ Prenetaa R， Jarraudb S， Vincent C. Isolation and characterization of a protein-tyrosine kinase and a phosphotyrosine-protein phosphatase from Klebsiella pneumoniae［J］.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2002，131: 103－112.

Identification of Specific Diagnostic Antigen for Klebsiella pneumoniae

LI Ting，ZHANG Li-fang，LIU Xing，LIU Xian-ju，LIU Jiang-ning，LI Wan-bo，LIN Shu-zhu
(Key Laboratory of Human Diseases Animal Model，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Institute of Laboratory Animal Sciences，Peking Union Medical College(PUMC)and Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS)，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo discover novel antigens ofKlebsiella pneumoniaefor establishing serological assays. Methods Total protein ofK.pneumoniae was separated by two-dimension electrophoresis(2DE)，reacting with polyclonal antibodies of common pathogenic bacteria by western blotting.The specific antigen was selected，expressed inE.coli andthen evaluated by ELISA。Results2DE map ofK.pneumoniaewas obtained.The protein spot that reacted to pAbs of K.pneumoniaebut unreacted to other pAbs in Western blotting was identified by mass spectrometry to be acid phosphatase (GI:238894261).The protein was subsequently expressed and purified.ELISA results had certified its high specificity and sensitivity。ConclusionAcid phosphatase ofK.pneumoniaeis the novel protein antigen for specific diagnosis of its infection.

Mice;Diagnosis;Specific antigen;Two dimension electrophoresis(2DE);Western blotting;Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA)

Q939.91

A

1671-7856(2010)07-0021-06

2010-03-29

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金 (DWS200705)。

李挺(1981－)，男，碩士生，研究方向:病原生物的血清學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail:lit@cnilas.org

李萬波。E-mail:li_wanbo2006@yahoo.com.cn