張 濤，黃順玲，孫克偉，譚德明，孟 瓊，陳 晨

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院感染病科，長沙 410007;2.湖南省衛(wèi)生廳，長沙 410005; 3.中南大學湘雅醫(yī)院感染病科，長沙 410005;4.湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，長沙 410007)

研究報告

構建啟動大鼠肝組織中TGF－β/Smad信號傳導通路的急性肝損傷動物模型

張 濤1，黃順玲2，孫克偉1，譚德明3，孟 瓊4，陳 晨1

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院感染病科，長沙 410007;2.湖南省衛(wèi)生廳，長沙 410005; 3.中南大學湘雅醫(yī)院感染病科，長沙 410005;4.湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，長沙 410007)

目的在傳統(tǒng)CCl4急性肝損傷模型的基礎上，構建啟動大鼠肝組織中的TGF－β/Smad信號傳導通路的急性肝損傷動物模型。方法將30只大鼠隨機分為3組，每組各10只，分別為模型組，對照組和空白組，模型組大鼠予小動脈夾夾閉肝總動脈15 min手術處理，隨后分別在第6天和第10天，予25%CCl4花生油溶液6 mL/kg體重腹腔注射;對照組則單用兩次CCl4，空白組不做任何處理;第二次CCl448 h后處死所有動物。結果模型組與對照組及空白組比較:血清指標ALT、AST、HA顯著上升(P＜0.01);肝組織HE染色病理觀測，肝組織出現(xiàn)明顯炎癥、變性、壞死，纖維組織增生等現(xiàn)象;PT－PCR檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原、TGF－β1、Smad3 mRNA表達顯著增強(P＜0.01);免疫組化檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原、TGF－β1、Smad3蛋白的表達增強(P＜0.01)。結論成功啟動急性肝損傷大鼠肝組織中的TGF－β/Smad信號傳導路，該急性肝損傷動物模型兼?zhèn)涓卫w維化活躍，和TGF－β/Smad信號傳導通路信號增強特征，在評價早期抗肝纖維化藥物及方法時具有耗時少、有效和經濟的特點，值得進一步研究。

CCl4;肝總動脈夾閉;TGF－β/Smad信號傳導通路;模型，動物

肝纖維化的形成是多因素所致，而目前傳統(tǒng)的肝纖維化動物模型大多采用單一因素處理，在慢性肝損傷基礎上刺激膠原組織增生而造成肝組織纖維化［1，2］，此類模型中TGF－β/Smad信號傳導通路明顯增強，但造模所需時間長、成本高、成模比例低。如能在急性肝損傷的模型中也能啟動TGF－β/Smad信號傳導通路，也就提示在急性肝損傷同時，可能伴隨著抗損傷過程的潛在活化，這在研究早期肝纖維化中意義重大，它不僅可評價藥物早期干預的效果，也較傳統(tǒng)的肝纖維化動物模型更省時，更經濟。但目前并沒有此類兼?zhèn)涓卫w維化活躍，和TGF－β/Smad信號傳導通路信號增強特征的急性肝損傷動物模型的文獻報導。本實驗擬在傳統(tǒng)CCl4急性肝損傷模型的基礎上，通過夾閉肝總動脈產生缺血后再灌注損傷，構建啟動大鼠肝組織中的TGF－β/Smad信號傳導通路的急性肝損傷動物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物:健康SD大鼠30只，清潔級，體重300 ±50 g/只，雌雄各半，湖南農業(yè)大學動物實驗中心提供［SYCK(湘)2003－0003］。

1.1.2 手術器械:止血鉗4把、有齒鑷、持針器各1把，12.5 cm顯微鑷1把，系線鑷2把，小動脈夾、縫合針數(shù)枚。

1.1.3 儀器:蘇州 Z20P5 10倍手術顯微鏡，美國PE公司PCR儀，美國Ewgle Eye II型病理圖像分析儀，美國 NUAIRE超低溫冰箱，上海天能 UV－2000紫外分析儀。

1.1.4 主要藥品及試劑:戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號:F20041117，25 g/瓶);分析純CCl4(湖南師大化學試劑廠，純度99.99%);RTPCR引物 (日本 TAKARA生物技術有限公司合成);兔抗大鼠 COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3親和抗體(武漢博士德生物工程有限公司);SABC試劑盒，含復合消化液，正常山羊血清，生物素化山羊抗兔lgG、SABC試劑等(武漢博士德生物工程有限公司);DAB顯色試劑盒，含顯色液A(DAB×20倍稀釋液)，顯色液B(H2O2×20倍稀釋液)，顯色液C (×20倍TBS濃縮緩沖液)(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模:2%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，劍突以下腹部剃毛、消毒，常規(guī)無菌手術規(guī)程操作。腹部正中切口2.5～3.0 cm，用無齒鑷提起腹肌沿腹白線剪開腹肌，止血鉗鉗夾切口兩側的腹肌，暴露肝臟。在10倍手術顯微鏡下，棉簽鈍性分離肝臟乳頭葉，在其下方找到肝總動脈分枝出肝固有動脈和胃十二指腸動脈處，祛除血管外壁的結締組織與脂肪組織，將各血管分離，在胃十二指腸動脈分出胃右動脈前方用絲線結扎血管，用小動脈夾夾閉肝總動脈，持續(xù)15 min后松開動脈夾，縫合腹壁肌層及皮膚，皮膚切口用70%酒精消毒。將手術后的大鼠，分別在隨后的第6天和第10天，以25% CCl4花生油溶液6 mL/kg體重腹腔注射，自由飲水、進食普通顆粒飼料。

1.2.2 實驗設計、分組:30只大鼠隨機分為3組，每組10只，分別為模型組、對照組、空白組。模型組予手術加CCl4處理，對照組單用兩次 CCl4處理，空白組不做任何處理，通過預實驗設定第二次給予CCl4后0.5 h、24 h、48 h、72 h為觀測點比較，選定第二次CCl448 h為最佳觀測時間，此時間點處死所有動物。

1.2.3 動物處死及取材:大鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹中線切皮，暴露游離膈肌心臟取血，離心取血清。充分暴露游離肝臟，從不同肝葉處剪下大小約1 cm ×1 cm ×0.5 cm的兩塊肝組織，用10%中性甲醛溶液固定，留作病理學和免疫組化檢測;再取約100 mg肝組織提取RNA。

1.2.4 觀察指標及各指標的測定

1.2.4.1 血清生化指標:由湖南中醫(yī)藥大學附一院檢驗科全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST，放射免疫分析法檢測HA。

1.2.4.2 肝組織:HE染色及病理組織學評估:甲醛固定標本，石蠟包埋，切片5 μm，二甲苯、乙醇脫水透明，染色后在鏡下觀察肝臟病變情況。

1.2.4.3 RT－PCR檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原(COL－1、COL－3)、TGF－β1、Smad3 mRNA的表達:TRIzol提取大鼠肝組織RNA，方法按照試劑說明書操作。以上四個指標引物參照文獻，并在基因庫上進行核對，GADPH為內參照。COL－1引物如下，上游引物序列5′－CAT AAA GGG TCA TCG TGG CTT C－3′，下游引物序列5′－GTG ATA GGT GAT GTT CTG GGA G－3′，擴增片段長度為489 bp;COL－3上游引物序列5′－AAC CCA GTA TTC TCC ACT CTT－3′，下游引物序列5′－CGA GGT AACAGA GGT GAA AGA－3′，擴增片段長度為 349 bp;TGF－β1上游引物序列 5′－CAA AGA CAT CAC ACA CAG TA－3′，下游引物序列5′－AGG TGT TGA GCC CTT TCC AG－3′，擴增片段長度為 441 bp;Smad3上游引物序列 5′－AAG GGC GAG CAG AAC GGG－3′，下游引物序列 5′－GGG ATG GAA TGG CTG TAG TC－3′，擴增片段長度為425 bp;GADPH上游引物序列5′－GGT GAA GGT CGG TGT GAA CGG A－3′，下游引物序列5′－TGT TAG TGG GGT CTC GCT CCT G－3′，擴增片段長度為245 bp;RT－PCR按照試劑盒說明操作，PCR條件為95℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 40 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)，72℃ 7 min。取10 μL PCR產物，瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測灰度值(IVD)，對條帶量化處理。

1.2.4.4 免疫組織化學檢測肝組織COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3蛋白表達:肝組織標本用10%甲醛液固定，石蠟包埋4 μm連續(xù)切片，采用SABC法作免疫組化染色。全自動圖像分析儀計算 COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3的陽性信號，并以此反映該樣本中 COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3含量的相對多少。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。各組之間采用Sidak法比較，方差不齊者進行H檢驗。

2 結果

2.1 血清ALT、AST及HA測定結果

對照組、空白組與模型組比較，在血清 ALT、AST及HA上差異顯著(P＜0.01)，對照組與空白組在以上三個指標比較差異同樣顯著(P＜0.01)，說明對照組與模型組在以上三個指標上明顯異常，且以模型組表現(xiàn)最為顯著(表1)。

表1 血清ALT、AST HA的測定結果(mean±s)Tab.1 Serum ALT，AST，HA of the determination results(mean±s)

2.2 肝組織病理組織學評估

肝組織病理檢查結果顯示:模型組肝細胞廣泛性脂肪變性及炎癥細胞浸潤，肝細胞索破壞，肝細胞呈片狀壞死，并可見纖維組織增生分割，纖維隔形成，部分肝小葉結構被破壞有假小葉形成趨勢;而對照組僅表現(xiàn)為急性肝損傷病理改變，且損傷程度小于模型組，未發(fā)現(xiàn)纖維組織增生(圖1，見彩插Ⅰ)。

2.3 RT-PCR檢測 COL-1、COL-3、TGF-β1、Smad3 mRNA的表達

RT－PCR檢測顯示與空白組、對照組比較，模型組在 COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3 mRNA的表達明顯增強，而對照組與空白組之間，二者沒有明顯差異(圖2)。

經PCR產物電泳及半定量分析，與模型組比較，對照組和空白組在 COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3的灰度值上差異顯著(P＜0.01)，對照組與空白組之間，4個測試值之間未見明顯差異(P＞0.05)(表2)。

2.4 免疫組化檢測肝細胞內COL-1、COL-3、TGF-β1、Smad3蛋白表達

以上各指標在肝細胞內蛋白水平的表達，以細胞質或細胞核及部分細胞膜，呈界限清楚的棕黃色或深棕色反應為陽性細胞。與空白組、對照組比較，在模型組表達明顯增加，主要分布在炎性細胞浸潤區(qū)、壞死灶、匯管區(qū)及纖維間隔等地方，免疫組化檢測結果具有特異性(圖3，見彩插1，2)。

圖2 各實驗組RT－PCR產物凝膠電泳圖Fig.2 RT－PCR products of gel electrophoresis in all experimental groups

表2 不同組的 COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3灰度值Tab.2 Gray value of different groups of COL－1，COL－3，TGF－β1，Smad3

經各實驗組肝細胞內 COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3免疫組化陽性信號定量結果分析，與模型組比較，對照組和空白組在 COL－1、COL－3、TGF－β1、 Smad3的免疫組化蛋白相對量差異顯著(P＜0.01)，對照組與空白組之間，4個測試值之間未見明顯差異(P＞0.05)(表3)。

表3 不同組的COL－1、COL－3、TGF－β1、Smad3免疫組化蛋白相對量Tab.3 Different groups of COL－1，COL－3，TGF－β1，Smad3 relative amount of protein by immunohistochemistry

3 討論

TGF－β/Smad信號傳導通路是肝纖維化時主要的信號轉導途徑［3，4］，是已知最強烈的肝纖維化促進因子－轉化生長因子β1(TGF－β1)［5］發(fā)揮生物學作用的主要通路，而Smad 3介導TGF－β1的大多數(shù)促纖維化效應［6，7］。故該通路是肝損傷后向肝纖維化病變的關鍵環(huán)節(jié)，阻斷該信號傳導通路，能較早地逆轉肝纖維化。因此構建啟動TGF－β/Smad信號傳導通路的模型，在急性肝損傷及肝損傷后早期肝纖維化的實驗研究中意義重大。

本實驗中，模型組在反映血清肝功能指標ALT、AST顯著增高;肝臟病理組織學上改變明顯，可見廣泛性肝細胞脂肪變性及炎癥細胞浸潤，肝細胞索破壞，肝細胞呈片狀壞死，表明肝細胞損傷嚴重。在急性肝損傷的同時也可見抗損傷機制的活化，表現(xiàn)為反映纖維化活躍的指標也明顯增高，如血清透明質酸 (hyaluronic acid，HA)在模型組組明顯升高，反映肝星狀細胞(hepatic stellate cellular，HSC)活化指標和肝臟細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的主要成分Ⅰ、Ⅲ型膠原也明顯增加。與此同時TGF－β1、Smad3 mRNA轉錄水平及蛋白表達水平明顯升高。而單用CCl4的對照組僅反映出急性肝損傷，并沒有出現(xiàn)明顯肝纖維化及 TGF－β/Smad信號通路的傳導。

本實驗模型是在以較大劑量的 CCl4，間隔5 d兩次腹腔注射，外加夾閉肝總動脈基礎上構建成功的。所見到的 TGF－β/Smad信號傳導通路被啟動，肝纖維化指標明顯升高的表現(xiàn)在其他的急性肝損傷模型中少見，查閱文獻及本實驗所示，在短時間若單以CCl4造模，并不能啟動TGF－β/Smad信號傳導通路。分析成功原因可能是本實驗中一方面通過對肝總動脈約15 min的夾閉，阻斷了肝臟的血液的供應，產生缺血后再灌注損傷(ischemiareperfusion injury，I－R)，促使 Kupffer細胞和白細胞被激活產生大量炎性細胞介質和氧自由基，使肝微循環(huán)障礙，加重肝臟損傷［8］;另一方面，使用了大劑量的CCl4重復注射，在肝內活化的－OOCl3直接損傷質膜，啟動脂質過氧化作用，破壞肝細胞膜性結構等，造成肝細胞變形壞死;兩種因素所造成的損傷可能有相加或協(xié)同作用，同時也可能加快了抗損傷機制的啟動，表現(xiàn)在TGF－β/Smad信號傳導通路信號增強，和Ⅰ、Ⅲ型膠原水平的升高。這些表象的存在，提示這一急性肝損傷動物模型也有可能對于研究早期抗肝纖維化藥物和方法有重要價值。今后我們將對模型形成機理、模型改進、實驗價值等做進一步的研究。

［1］ 曾林，王慧芳，竇如海.肝纖維化動物模型的研究概況［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2003，13(2):124.

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Construction of an Acute Liver Damage Animal Model for Priming TGF-β/Smad Signal Conduction Pathway in Hepatic Tissue of Rats

ZHANG Tao1，HUANG Shun－ling2，SUN Ke－wei1，TAN De－ming3，MENG Qiong4，CHEN Chen1
(1.Department of Infectious Diseases，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Hunan Chinese Medical University，Changsha 410007，China; 2.Hunan Provincial Department of Health，Changsha 410005，China; 3.Department of Infectious Diseases，Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410008，China; 4.Laboratary animal Centre，Hunan Chinese Medical University，Changsha 410007，China)

ObjectiveTo construct an acute liver damage animal model for priming TGF－β/Smad signal conduction pathway in hepatic tissue of rats on the basis of traditional model induced by carbon tetrachloride(CCl4). Methods Thirty rats were randomly divided into three groups as model group，control group and blank group.The model group was prepared by clamping the hepaticarterycommuniswith bulldogclamp for 15 minuteswasinjected intraperitoneally with 25% of CCl4contained in arachis oil on the following sixth and tenth day after the operation，respectively.The dosage of the liquor was 6 mL per kg.The control group was only injected intraperitoneally with CCl4twice，while the blank group without any treatment.After 48 hours of the second injection，the rats were sacrificed. Results The levels of ALT，AST and HA in plasma were apparently increased in model group compared with that incontrol group and blank group(P ＜0.01).The liver HE staining in model group showed that there were obvious inflammation，apomorphosis，cellular necrosis and fibroplasias，the gene expression and protein expression of typeⅠ，Ⅲcollagen，TGF－β1 and Smad3 enhanced obviously with RT－PCR detection and Immunohistochemistry technology in the model group than that in control group and blank group(P ＜0.01)。ConclusionAnimal model of acute liver injury have two features:active liver fibrosis and TGF－β/Smad signaling pathway signal enhancement.The acute liver injury rat model priming TGF－β/Smad signal conduction pathway in liver tissue has advantages of less time consuming，utility and economy in evaluating the drugs and methods for early anti－h(huán)epatic fibrosis.

CCl4;Clamping the hepatic artery communis;TGF－β/Smad signal conduction pathway;Model，animal

R－332

A

1671－7856(2010)07－0005－05

2010－01－28

湖南省科技計劃項目(NO:2007fj4176)，湖南省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研基金(NO:2006103)。

張濤(1977－)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事傳染病學及肝病研究。E－mail:emailzt@tom.com

黃順玲(1958－)，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事肝病防治及研究。E－mail:huangshunlin@163.com