陳 煒，馮 娟，施海霞，梁 虹，張連峰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心 衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

技術(shù)方法

人源化小鼠人源細(xì)胞檢測(cè)方法

陳 煒，馮 娟，施海霞，梁 虹，張連峰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心 衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的 人源化小鼠在人類疾病與再生醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛應(yīng)用，為獲得一種理想的人源化小鼠檢測(cè)方法，研究人特異性線粒體序列擴(kuò)增作為人源化動(dòng)物模型中人類DNA檢測(cè)方法的可行性。方法設(shè)計(jì)人線粒體DNA特異性引物，并用該引物對(duì)人臍血造血干細(xì)胞嵌合體小鼠進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果在人源化動(dòng)物模型的人類DNA檢測(cè)中，這種人線粒體DNA的PCR檢測(cè)方法能夠達(dá)到理想的特異性與靈敏性，是一種理想的嵌合體小鼠檢測(cè)方法。結(jié)論獲得了一種理想的人源化小鼠人源細(xì)胞檢測(cè)方法。

人源化小鼠;臍血干細(xì)胞;線粒體DNA

顯微注射法制備嵌合體動(dòng)物的方法最早出現(xiàn)在1968年，Gardner［1］報(bào)道將小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞顯微注射到另一種毛色的小鼠囊胚中后，獲得毛色混合的嵌合體小鼠。Harder等［2，3］將人臍血造血干細(xì)胞注射到小鼠囊胚中后，從小鼠造血系統(tǒng)中檢測(cè)到人源化細(xì)胞嵌合。人源化小鼠的出現(xiàn)為在活體內(nèi)進(jìn)行人類生物學(xué)研究提供了可能，人源化嵌合體動(dòng)物研究的發(fā)展需要一種簡(jiǎn)便易行、且靈敏度較高的人源化細(xì)胞基因檢測(cè)技術(shù)。

動(dòng)物線粒體DNA(mitochondria DNA，mtDNA)是一種共價(jià)閉合、環(huán)狀雙鏈DNA分子，線粒體DNA為多拷貝基因，每個(gè)細(xì)胞器含有數(shù)個(gè)到上千個(gè)不等的線粒體，而每個(gè)線粒體可含有數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)不等的線粒體DNA分子，除卵母細(xì)胞外，普通細(xì)胞中的線粒體DNA基因組可以高達(dá)一萬(wàn)個(gè)［4］。因此，本研究將利用 mtDNA的高拷貝特性，研究人特異性mtDNA保守序列PCR擴(kuò)增作為人源化動(dòng)物模型中人類DNA檢測(cè)方法的可行性。

1 材料和方法

1.1 人造血干祖細(xì)胞制備

正常健康新生兒臍血由北京市臍帶血造血干細(xì)胞庫(kù)提供(孕母排除病毒性肝炎、艾滋病和梅毒感染)。Ficoll-Paque PLUS淋巴細(xì)胞液 (密度1.077)，購(gòu)自GE Healthcare;EasySep負(fù)選人造血干祖細(xì)胞(含CD41)試劑盒和EasySep magnet購(gòu)自加拿大stemcell公司。臍血用肝素鈉抗凝，12 h內(nèi)分選。用Ficoll Paque PLUS淋巴細(xì)胞分離液以不連續(xù)密度梯度離心，收集界面白膜層懸浮細(xì)胞即為臍血單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，MNC再經(jīng)EasySep負(fù)選人造血干祖細(xì)胞試劑盒分選獲得人造血干祖細(xì)胞。

1.2 囊胚供體鼠與顯微注射

用3～4周齡 ICR雌鼠作為囊胚供體鼠。采用PMSG和 hCG間隔48 h腹腔注射促排卵。hCG注射后與 ICR雄鼠合籠。次日早晨檢查陰栓，見(jiàn)栓當(dāng)天為受精0.5 d。第2.5天取桑椹胚，KSOM液培養(yǎng)過(guò)夜，至次日囊胚充分?jǐn)U張后進(jìn)行造血干細(xì)胞的顯微注射，每個(gè)囊胚內(nèi)注射15～20枚造血干細(xì)胞。

1.3 結(jié)扎雄鼠和假孕鼠的準(zhǔn)備

取6周 左右 ICR雄鼠，雙側(cè)輸精管結(jié)扎，手術(shù)后恢復(fù)3～4周，與雌鼠交配，連續(xù) 3次見(jiàn)栓且未引起雌鼠妊娠的作為假孕交配用結(jié)扎雄鼠。取正常6～8周 以上 ICR雌鼠與結(jié)扎雄鼠交配，作為假孕母鼠。將顯微注射后重新擴(kuò)張的囊胚移植到假孕鼠2.5 d子宮中。

1.4 人源化嵌合體的PCR鑒定

人DNA梯度稀釋實(shí)驗(yàn)中，在小鼠DNA中依次添加0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、5%和10%的人類DNA。子代小鼠出生后計(jì)數(shù)小鼠個(gè)數(shù)，9～14 d剪尾，裂解組織提取DNA，分別用下列引物進(jìn)行嵌合體小鼠的PCR檢測(cè)。人線粒體DNA特異性引物hmtDNA-FP:5′CAC CCT ATT AAC CAC TCA CG 3′;hmtDNA-RP:5′-ATG TCT GTG TGG AAA GCG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為264 bp。小鼠與人線粒體DNA通用引物序列mtDNA-FP:5′-GGA TTA GAT ACC CCA CTA TGC-3′;mtDNA-RP:5′-GCT ACA CCT TGA CCT AAC GT-3′，PCR產(chǎn)物大小為 268/ 273 bp(人/小鼠)。hAlu-FP:5′-CTG GGC GAC AGA ACG AGA TTC TAT-3′;hAlu-RP:5′-CTC ACT ACT TGG TGA CAG GT TCA-3′，PCR產(chǎn)物大小224 bp。反應(yīng)條件:預(yù)變性 94℃ 3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，人 DNA梯度稀釋實(shí)驗(yàn)中PCR循環(huán)數(shù)為25個(gè)循環(huán)，嵌合體小鼠檢測(cè)PCR實(shí)驗(yàn)中共40個(gè)循環(huán)。hAlu PCR擴(kuò)增條件參照Kaneko等［5］，94℃變性30 s，60℃退火30s，72℃延伸30 s，擴(kuò)增結(jié)束后，72℃延伸 10 min，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在紫外透射儀下分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 人類特異性mtDNA序列和PCR引物的確定

利用DNAMAN序列分析軟件，對(duì)人類mtDNA (GI:17981852)和小鼠mtDNA(GI:118200767)的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)下列對(duì)應(yīng)片段的序列同源性僅為34.97%(圖1)，且通過(guò)NCBI blast分析表明該人類mtDNA片段在小鼠基因組中無(wú)同源序列。

本研究針對(duì)這段特異性序列設(shè)計(jì)了人線粒體DNA特異性引物。同時(shí)針對(duì)小鼠與人類線粒體DNA同源序列設(shè)計(jì)了一對(duì)通用引物作為內(nèi)參對(duì)照引物。分別采用人線粒體DNA特異性引物和人鼠線粒體DNA通用引物對(duì)梯度稀釋的人 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明PCR循環(huán)數(shù)為25個(gè)循環(huán)時(shí)，電泳條帶的亮度隨樣本中人DNA含量的增加而增加(圖2)。

2.2 人臍血造血干細(xì)胞小鼠嵌合體的檢測(cè)

分別提取出生1周、2周、4周和8周的小鼠鼠尾DNA，用hmtDNA特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在110只小鼠中檢測(cè)到25只嵌合體陽(yáng)性小鼠，陽(yáng)性率為23%。圖3為其中一只嵌合體小鼠的PCR檢測(cè)結(jié)果。

2.3 hmtDNA PCR檢測(cè)與hAlu序列PCR檢測(cè)的靈敏度比較

分別采用hmtDNA和hAlu引物對(duì)嵌合體小鼠DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明hmtDNA引物PCR檢測(cè)的特異性與靈敏性均比hAlu引物更理想(圖4)。

3 討論

由于人類Alu基因序列的高度物種特異性和可重復(fù)性，Alu基因特異性引物被許多研究者用于混合物種樣本中人DNA的鑒定。如McKenzie等［6］首次用32P標(biāo)記 Alu探針檢測(cè)人鼠混合樣本中的人DNA的存在。Zubair等［7］采用Alu引物分析注射人淋巴癌細(xì)胞的小鼠組織中的人源化細(xì)胞數(shù)，但只有當(dāng)每μg小鼠DNA中的人DNA量達(dá)到1～10 ng水平時(shí)才能檢測(cè)。Kim等［8］的方法能夠檢測(cè)出 2× 106雞細(xì)胞中的一個(gè)人類細(xì)胞，但反應(yīng)體系中采用了32P標(biāo)記dCTP，且在電泳后還需要對(duì)PCR條帶進(jìn)行密度掃描。Schneider等［9］以 Alu基因?yàn)槟０暹M(jìn)行定量PCR，能夠檢測(cè)中1×106個(gè)小鼠細(xì)胞中的一個(gè)人類細(xì)胞，該方法在檢測(cè)技術(shù)上有了顯著改進(jìn)，但由于費(fèi)用較昂貴，且需要 LightCycler實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)，尚不能滿足常規(guī)嵌合體基因型檢測(cè)的需要。

圖1 人類和小鼠mtDNA部分序列的比對(duì)結(jié)果Fig.1 Sequence alignment of Homo sapiens and Mus musculus mitochondrion

圖2 梯度稀釋人DNA的 PCR鑒定Fig.2 Genotyping of human genomic DNA with PCR

圖3 人臍血造血干細(xì)胞—嵌合體小鼠DNA的PCR鑒定Fig.3 Genotyping of human umbilical cord blood-derived cells in human-mouse chimeras DNA with PCR

圖4 hmtDNA與hAlu引物擴(kuò)增效果比較Fig.4 Comparison of PCR amplification in human-mouse chimeras genomic DNA with PCR

哺乳動(dòng)物mtDNA全長(zhǎng)16.5 kb左右，定位2種rRNA、22種參與線粒體蛋白合成的tRNA和13種涉及呼吸作用和氧化磷酸化功能的多肽鏈基因。具有分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、編碼效率高、拷貝數(shù)多、進(jìn)化速率快和嚴(yán)格的母系遺傳等共同特性。本研究利用mtDNA的高拷貝特性，用人特異性mtDNA保守序列PCR擴(kuò)增作為人源化動(dòng)物模型中人類DNA檢測(cè)方法。結(jié)果表明，在人源化動(dòng)物模型的人類DNA檢測(cè)中，這種線粒體DNA的PCR檢測(cè)方法的特異性與靈敏性均比hAlu更理想。

以往研究表明，恒河猴 MSCs可以在 ICR小鼠胚泡內(nèi)存活［10］，并且在體外可以隨囊胚孵出。用人臍血造血干細(xì)胞進(jìn)行小鼠囊胚顯微注射也得到了相同的結(jié)論［2，3］。這說(shuō)明靈長(zhǎng)類成體干細(xì)胞可以在小鼠胚胎中生長(zhǎng)發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)在人源化小鼠出生后8周時(shí)仍可檢測(cè)人源化細(xì)胞的存在。

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Detection Method for Humanized Cells in Human-mouse Chimeras

CHEN Wei，F(xiàn)ENG Juan，SHI Hai-xia，LIANG Hong，ZHANG Lian-Feng
(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Heath，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences＆Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo extensively analyze the genotyping methodology for human-mouse chimeras，which is mandatory for research on regenerative medicine and some human diseases，a feasibility study was conducted to find out if amplification of human specific mitochondrial sequences could be applied to accurately and sensitively quantify of human genomic DNA in humanized animal model。MethodsThe primers of amplification of human specific mitochondrial sequences was designed and used to amplificate the humanized cells in human umbilical cord blood-derived cells-mouse chimeras。ResultsThese results demonstrated that this new approach provided the necessary level of specificity and sensitivity。ConclusionThis method comprises a simple and reliable assay system for studies of human-mouse chimeras.

Human-mouse chimeras;Human umbilical cord blood-derived cells;Mitochondria DNA(mtDNA)

R-33

B

1671-7856(2010)07-0063-04

2010-05-10

國(guó)家科技重大專項(xiàng)“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”(2009ZX10004-307)。

張連峰。E-mail:zhanglianfeng@cnilas.pumc.edu.cn

梁虹。E-mail:lianghong5@gmail.com