王茂芊 ，吳則東 ，陳 麗 ，王華忠

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特 010018；2.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080）

甜菜是我國重要的糖料作物之一，已經(jīng)確立為黑龍江省的主要農(nóng)作物。但由于中國不是甜菜起源國，缺少種質(zhì)資源，遺傳基礎(chǔ)狹窄，而且我國的甜菜育種多數(shù)仍然依賴于植株表型性狀的選擇及一些生理生化指標的測定，很少從分子標記的遺傳層面進行深入研究，致使育種水平提高緩慢。為了培育出適合黑龍江省的更為高產(chǎn)、抗病、高糖的甜菜新品種，避免遺傳基礎(chǔ)過于狹窄可能造成的危害，有必要對東北地區(qū)的甜菜資源進行親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析。近年來，我國有關(guān)甜菜的遺傳多樣性和分子標記育種的研究已有所進展。路運才等[1]利用RAPD分子標記技術(shù)對我國的15個甜菜多倍體品種，于歆等[2]應(yīng)用AFLP技術(shù)對甜菜雙豐系列的8個品種分別研究表明，我國甜菜的遺傳材料基礎(chǔ)狹窄。田自華等[3-4]對甜菜細胞質(zhì)雄性不育系及其保持系的線粒體DNA和葉綠體DNA進行RAPD分析表明，甜菜不育系和保持系的葉綠體DNA之間不存在差異，而在線粒體DNA之間存在豐富的多態(tài)性。目前分子標記技術(shù)主要包括AFLP、RFLP、SRAP、SSR、RAPD、ISSR等標記方法[5-7]。SRAP（sequence-related amplified polymorphism）即相關(guān)序列擴增多態(tài)性，又叫基于序列擴增多態(tài)性（sequence-based amplified polymorphism，SBAP），近幾年應(yīng)用比較廣泛。SRAP標記在中國已成功應(yīng)用于棉花[8-9]、西瓜[10]、油菜[11]、蓮藕[12]、甘薯[13]和野牛草等植物[7]。 但利用 SRAP分析甜菜的并不多，選用的引物也較少。王華忠等[14-15]應(yīng)用SRAP分子標記分析了49個甜菜材料的遺傳多樣性，并對SRAP引物組合進行了篩選以及甜菜SRAP-PCR反應(yīng)體系進行了優(yōu)化。本試驗對94份東北地區(qū)甜菜品系材料和6個國外品種進行SRAP分子標記分析，從88對引物組合中篩選出有效引物組合33對，可以有效地對甜菜進行分子標記分類和親緣關(guān)系分析，為指導(dǎo)種質(zhì)資源引進，雜交組合親本選擇和分子標記輔助選擇育種等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗參試材料共100份(見表1)，其中多胚二倍體品系48份，多胚四倍體品系35份，單胚雄性不育系和保持系11份，另有6份外國品種作對照。均為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所選育或引進的代表性材料。

1.2 方法

田間鑒定試驗與生物學(xué)性狀調(diào)查在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所進行，SRAP分子標記分析在黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點實驗室進行。

1.2.1 田間鑒定試驗與生物學(xué)性狀調(diào)查 2008年4月25日，在中國農(nóng)科院甜菜研究所試驗地種植不同類型甜菜品系100份，隨機區(qū)組排列，4次重復(fù)，2行區(qū)，行長10 m，株距25 cm。利用國際通用的Beta屬鑒定性狀的形態(tài)指標及褐斑病病情進行調(diào)查，收獲時測定根產(chǎn)量，調(diào)查根腐病株數(shù)，收獲后2～3 d檢測含糖率。每個材料按常規(guī)調(diào)查30株，計算平均數(shù)。經(jīng)濟性狀主要概括為如下6種類型：高產(chǎn)高糖高抗型、高產(chǎn)高糖中抗型、高產(chǎn)中糖低抗型、高產(chǎn)中糖中抗型、高產(chǎn)低糖低抗型、中產(chǎn)高糖高抗型。

1.2.2 基因組DNA的提取 基因組DNA的提取采用改良CTAB法[16]，提取的DNA質(zhì)量和濃度采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（每孔加樣為 1μL 樣品 DNA、4μL ddH2O、1μL 6×Loading Buffer）。 樣品稀釋到 10 ng/μL，置-20℃冰箱中保存。

1.2.3 SRAP-PCR體系 在20μL SRAP-PCR體系中含2.5 mmol/L的dNTPs 1.6μL，1 U Taq DNA聚合酶，上下游引物各60 ng，模板DNA 40 ng，用重蒸水調(diào)整體系使終體積為20μL。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3 min；94℃l min，35℃l min，72℃l min 5個循環(huán)，隨后的35個循環(huán)復(fù)性溫度提高到50℃，最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.4 電泳分析檢測 本試驗的PCR產(chǎn)物分別采用了BioRAD公司生產(chǎn)的電泳儀及電泳槽和北京六一廠生產(chǎn)的DYC-30電泳槽，電泳緩沖液均為1倍 TBE。前者6%變性聚丙烯酰胺凝膠分離，電泳時，先在70 W恒功率下預(yù)電泳30 min，然后把上樣孔中的氣泡充分驅(qū)逐干凈，點樣前取擴增產(chǎn)物4 μL加2 μL 10倍上樣緩沖液（47.5 mL甲酰胺、2.0 mL 0.5 M EDTA、溴酚藍0.125 g，定容到50 mL）混勻在PCR儀上95℃變性處理5 min，上樣后用70 W恒功率，時間大約70 min。當(dāng)溴酚藍到達垂直板底部時，將膠剝下，按如下順序進行顯色：將長板放入2 L 10%的醋酸溶液中，輕輕搖動30 min；蒸餾水中漂洗2次，每次3 min；染色（在2 L蒸餾水中加入2 g硝酸銀，3 mL甲醛）30 min；染色完畢后在蒸餾水中迅速漂洗3～4 s，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的碳酸鈉溶液中（其中含有3 mL甲醛，400 μL 10 mg/L的硫代硫酸鈉），在搖床上顯影至條帶清晰為止。后者8%變性聚丙烯酰胺凝膠分離，點樣前取擴增產(chǎn)物4μL加雙色指示劑2μL混合（離心），每孔點樣5μL，上樣后調(diào)至100～160V大約2h將膠剝下按如下順序顯色：將膠置于100mL固定液中（10%無水乙醇，0.5%冰乙酸），脫色搖床上緩慢搖動 6min，2次；倒去固定液，加入100mL 0.2%AgNO3溶液，脫色搖床上緩慢搖動 12min；倒去AgNO3溶液，用100mL ddH2O清洗30s；加入0.002%硫代硫酸鈉100mL，脫色搖床上緩慢搖動30s后倒去；加入100mL顯色液（1.5%氫氧化鈉，0.4%甲醛），脫色搖床上緩慢搖動至肉眼看到清晰的DNA條帶；用清水將膠清洗數(shù)次；保鮮膜包好，讀條帶。

1.2.5 引物篩選 用4個有代表性的品系(27、51、70、95)對88對SRAP標記組合（表2）進行篩選。用多態(tài)性好、易于區(qū)分的引物組合進行檢測。

表1 供試材料及其主要特性

1.2.6 遺傳多樣性分析 用篩選到的33對SRAP引物組合對100份材料的DNA樣品進行PCR擴增。將電泳圖譜上清晰出現(xiàn)的條帶記為“1”，同一位置無條帶記為“0”，獲得“0”和“1”組成的原始矩陣后，轉(zhuǎn)化為mega的標準格式，進行聚類分析。按Nei和Li等的方法，遺傳相似系數(shù)GS=2X12/（X1+X2），遺傳距離GD=-lnGS。其中X1、X2分別為成對比較的2個品種的擴增帶數(shù)，X12為共有帶數(shù)。利用Mega3.1軟件分析，采用非加權(quán)類平均法構(gòu)建聚類圖。重復(fù)運算1000次后獲得自展值(Boot-strap)，以百分數(shù)值表示。利用軟件中的Compute over-all mean計算組內(nèi)品種間平均遺傳距離，用LSD法[14]檢驗遺傳距離及相似性的差異顯著性。

表2 SRAP引物序列與名稱

2 結(jié)果與分析

2.1 生物學(xué)和經(jīng)濟學(xué)性狀分類

根據(jù)材料的主要性狀和田間鑒定結(jié)果（表1），以經(jīng)濟學(xué)性狀分類，依據(jù)根產(chǎn)量、含糖率、抗病性分為6類，分別為高產(chǎn)高糖高抗型、高產(chǎn)高糖中抗型、高產(chǎn)中糖低抗型、高產(chǎn)中糖中抗型、高產(chǎn)低糖低抗型、中產(chǎn)高糖高抗型。一般而言，單胚雄性不育系和保持系以及雜交改良品系表現(xiàn)為高產(chǎn)、低糖、低抗，多胚二倍體品系表現(xiàn)為中產(chǎn)、高糖、高抗，多胚四倍體品系表現(xiàn)為高產(chǎn)、高糖、高抗，國外品種表現(xiàn)為高產(chǎn)、低糖、低抗，但是具有抗叢根病特性。

2.2 SRAP分子標記的多態(tài)性分析

使用4個表型差異比較明顯的甜菜品系對88對SRAP引物組合進行擴增，共篩選出SRAP引物組合33對。SRAP標記的多態(tài)性見表3，每對引物組合產(chǎn)生16～28條擴增帶，33對引物組合共產(chǎn)生694條擴增帶，其中有424條呈多態(tài)性，平均每個引物組合產(chǎn)生21.0條擴增帶和12.8條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率平均為61.0%。從結(jié)果上看，篩選出的33對引物在100份甜菜材料上均產(chǎn)生了數(shù)量不等的特異性條帶，多態(tài)性較豐富，較好地顯示了該作物的遺傳多樣性。東北材料與外國材料相比較，外國材料的擴增條帶只有8～12條，而東北材料有16～28條之多，顯著多于外國材料。這表明東北材料與外國材料之間確實存在較大差異，有可能東北材料的基因組成比較復(fù)雜，有許多不良基因影響產(chǎn)量的表現(xiàn)。

表3 SRAP引物組合、擴增帶數(shù)及多態(tài)性帶數(shù)

2.3 遺傳距離與遺傳相似性分析

利用33對SRAP引物組合產(chǎn)生的694條DNA片段計算94份材料的平均遺傳距離為0.3636，平均遺傳相似系數(shù)為0.6952。單胚不育系和保持系的遺傳距離的變動幅度及平均遺傳距離最小，而平均遺傳相似系數(shù)最大，如編號25和26二者遺傳距離在單胚品系中最小0.1121，遺傳相似系數(shù)最大0.8940，因二者是一對同型的單胚不育系和保持系。多胚二倍體品系中，編號44和48遺傳距離較小0.1724，遺傳相似系數(shù)為0.8416，可能是由于二者親本來源相同。在多胚四倍體品系中編號91和94遺傳距離最小為0.1379，遺傳相似系數(shù)最大為0.8712，可能是由于來源于相近的誘變源所致。而編號70和79遺傳距離最大0.4052，遺傳相似系數(shù)最小0.6668，說明二者遺傳基礎(chǔ)較遠。在國外品種中，編號95和96遺傳距離最小0.0690，遺傳相似系數(shù)最大0.9333，可能二者來源基本相同。以上分析顯示了各類型材料之間的親緣關(guān)系和遺傳基礎(chǔ)不同。從遺傳相似系數(shù)平均值可見，國外引進品種0.8642>單胚品系0.7910>多胚四倍體品系0.7497>多胚二倍體品系0.7101。說明國外品種的性狀整齊，均屬于高產(chǎn)低糖抗叢根病型。相比之下，由于國產(chǎn)單胚品系、多胚二倍體和四倍體品系數(shù)量較多，遺傳基礎(chǔ)不同，基因組成比較復(fù)雜，所以遺傳相似系數(shù)相對較小。

2.4 聚類分析

按照UPGMA方法進行聚類分析，得到100份甜菜材料的SRAP聚類圖（圖1），在遺傳距離0.20處，可將參試材料分為四大類群，分別為高產(chǎn)低糖低抗型品系、中產(chǎn)高糖高抗型品系、高產(chǎn)高糖高抗型品系、高產(chǎn)低糖抗叢根病型的品系和外國品種。較好地顯示了甜菜材料豐富的遺傳多樣性和遺傳基礎(chǔ)的差異性。第一類群有 48 個材料 （圖 1 中從上至下的順序）， 編號為 2、3、22、18、16、27、28、25、26、23、24、12、13、21、29、31、38、36、11、30、37、42、51、55、19、43、8、40、4、6、7、14、32、47、44、48、34、49、83、5、9、1、75、17、33、15、20、68， 其中包括全部的單胚品系、2個多胚四倍體品系和大部分多胚二倍體品系，高產(chǎn)低糖低抗型占同類型總數(shù)的77%。第二類群有22個材料，編號為10、58、87、59、79、84、91、94、73、92、50、78、66、77、70、71、89、69、74、72、61、76，其中包括 4 個多胚二倍體品系和18個多胚四倍體品系，中產(chǎn)高糖高抗型占68%。第三類群有20個材料，編號為67、90、54、80、60、64、62、63、65、88、81、85、86、82、93、52、53、56、57、41，包括 6 個多胚二倍體品系和14個多胚四倍體品系，其中75%為高產(chǎn)高糖高抗型。第四類群有10個材料，編 號 為 35、39、45、46、98、100、99、97、95、96，包括4個多胚二倍體品系和6個外國引進品種，其中高產(chǎn)低糖抗叢根病型占60%。分析可見，聚類結(jié)果與材料的生物學(xué)和經(jīng)濟學(xué)性狀分類基本吻合，其中具有相近親緣關(guān)系的材料首先聚到一起，如同型的單胚不育系和保持系 25號（JV834-2）和 26 號（JV34-2）二者遺傳距離在單胚品系中最小0.1121，遺傳相似系數(shù)最大0.8940，同型的單胚不育系和保持系23和24聚合到一起，遺傳距離為0.1466，遺傳相似系數(shù)為0.8636。由聚類圖可見，國外引進品種聚類到一起，可能是由于參試的外國材料數(shù)量較少，而且性狀比較整齊，擴增條帶只有8～12條。只有4個東北材料與外國材料聚類到一起，可能是這幾個東北材料是外國引進品種改良雜交而成，遺傳基礎(chǔ)相近之故。

3 討論

本次試驗的創(chuàng)新點在于，選用的材料較多，樣本更加齊全，引物數(shù)量比以往增加較多，多態(tài)性較高，其中正向引物8個，反向引物11個，引物組合88對，篩選出可用引物數(shù)量多達33對，更有利于正確評價甜菜種質(zhì)資源的遺傳多樣性和遺傳基礎(chǔ)，為育種親本選配和資源引進提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。試驗結(jié)果表明，SRAP分子標記將參試材料分成四大類，與田間經(jīng)濟性狀鑒定及生物學(xué)調(diào)查結(jié)果基本相符。說明利用SRAP標記能夠有效地進行甜菜品種的分子標記鑒定以及不同材料間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析。但是，試驗中也發(fā)現(xiàn)了表現(xiàn)比較特殊的情況，如從聚類圖來看，只有4個甜菜品系和外國品種歸為一類，可能是由外國品種雜交改良而成，遺傳基礎(chǔ)相近。從SRAP擴增條帶顯示來看，外國材料的多態(tài)性條帶只有8～12條，東北材料有16～28條之多，顯著多于外國材料，表明東北材料與外國材料之間確實存在較大差異，東北材料中缺少豐產(chǎn)基因型，這可能是由于中國材料的基因組成比較復(fù)雜，許多不良基因影響產(chǎn)量的表現(xiàn)。由聚類圖譜分析，有些二倍體和四倍體被聚合到一類，這可能是因其具有一定親緣關(guān)系或經(jīng)濟學(xué)性狀相似所致。國外引進品種聚類到一起，可能是由于參試的外國材料數(shù)量較少，性狀比較整齊，而且高產(chǎn)性狀突出，且抗叢根病所致。試驗表明，只有通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對我國的甜菜種質(zhì)資源進行詳細的分類和研究，才能為甜菜遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、重要性狀基因標記定位與克隆、分子標記輔助選擇育種提供良好的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

試驗表明，利用SRAP分子標記可以有效地進行甜菜品種的分子標記鑒定以及不同材料間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析。該法是2001年Quiros博士利用SRAP技術(shù)對蕓薹屬作物甘藍進行DNA擴增，獲得的片段有45%與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知基因相同[17]。作為一種新型的DNA分子標記，SRAP標記的特點為多態(tài)性高，產(chǎn)率中等；重復(fù)性好；操作簡單；在基因組中分布均勻；較易對擴增得到的目的片段進行測序；引物具有通用性，而且其正向引物可以與反向引物兩兩搭配組合，因此用少量的引物可以得到多個引物組合，提高了引物的使用效率，降低試驗成本。

4 結(jié)論

利用SRAP分子標記能夠簡便有效地進行甜菜品種的分子標記鑒定以及不同材料間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析。按照UPGMA方法進行聚類分析，在遺傳距離0.20處，可將東北地區(qū)的甜菜材料大致分為四大類群，分別為高產(chǎn)低糖低抗型的單胚品系和多胚二倍體品系；中產(chǎn)高糖高抗型的多胚四倍體品系和二倍體品系；高產(chǎn)高糖高抗型的多胚四倍體品系和二倍體品系；高產(chǎn)低糖抗叢根病型的品系和外國引進品種。聚類結(jié)果與生物學(xué)和經(jīng)濟學(xué)性狀分類基本吻合，較好地顯示了甜菜材料豐富的遺傳多樣性和遺傳基礎(chǔ)的差異性。結(jié)果表明，東北地區(qū)甜菜材料具有豐富的遺傳多樣性和遺傳基礎(chǔ)差異。中外材料的遺傳基礎(chǔ)存在明顯的差異,只有4個甜菜品系和外國品種歸為一類，可能是由外國品種雜交改良而成，遺傳基礎(chǔ)相近。本試驗不足之處在于只進行了類群劃分，反映了DNA水平上的遺傳差異，但是不能確定材料之間究竟是哪些基因位點上的差異，以后應(yīng)有目的地尋找豐產(chǎn)、高糖、抗性基因標記，為甜菜育種開辟新途徑。

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