袁靜 李凱

1971年Folkman教授提出了抗血管生成治療理論[1]，即腫瘤生長(zhǎng)依賴新生血管，阻止其生成可阻斷腫瘤營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。近年來，一些抗血管生成藥物和化療聯(lián)合取得了較好療效，但兩種藥物的各自特點(diǎn)比較、聯(lián)合時(shí)的最佳用藥順序及分子機(jī)制等仍為亟待闡明的問題。本研究以荷瘤鼠為動(dòng)物模型，采用重組人血管內(nèi)皮抑素（恩度，rh-endostatin endostar）和多西紫杉醇（docetaxel）進(jìn)行干預(yù)，通過觀察瘤組織基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP）及其調(diào)控指標(biāo)變化以及瘤組織微血管密度（microvessel density, MVD）和瘤體生長(zhǎng)，對(duì)該問題進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及癌細(xì)胞株 BALB/c-nu/nu小鼠購(gòu)自北京維通利華公司，4周齡-5周齡，雌性，體重16 g -18 g，于無菌條件下飼養(yǎng)。人肺癌A549細(xì)胞株由天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院免疫實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.1.2 藥物和試劑 重組人血管內(nèi)皮抑素由先聲藥業(yè)提供，批號(hào)：20081004。多西紫杉醇，由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供，批號(hào)：08082311?；|(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑、誘導(dǎo)劑染色所用一抗均購(gòu)自Santa Cruz公司，CD34抗體購(gòu)自Abcam公司。二抗及DAB等購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法 A549細(xì)胞傳代培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液中，37oC、5%CO2條件下貼壁生長(zhǎng)。

1.2.2 小鼠移植瘤模型的建立 調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×107個(gè)/mL，于小鼠腹股溝皮下注射0.1 mL/只。待瘤體大于150 mm3時(shí)，剪成直徑2 mm的小塊，接種至小鼠左側(cè)腹股溝皮下形成移植瘤。

1.2.3 動(dòng)物分組與給藥 第一階段：接種10天、成瘤體積達(dá)到要求后將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成2組，8只/組，配制好的多西紫杉醇以注射用水稀釋后腹腔注射，重組人血管內(nèi)皮抑素以生理鹽水稀釋后于移植瘤對(duì)側(cè)皮下注射給藥。重組人血管內(nèi)皮抑素組為重組人血管內(nèi)皮抑素400 μg·d-1，d1-d14。多西紫杉醇組為多西紫杉醇10 mg·kg-1·3d-1，d1-d14。小鼠均于第14天處死、收獲瘤塊。

第二階段：接種10天、成瘤體積達(dá)到要求后將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3組，8只/組。重組人血管內(nèi)皮抑素與多西紫杉醇給藥方法同前，生理鹽水皮下注射、注射用水腹腔注射給藥。同時(shí)用藥組為重組人血管內(nèi)皮抑素400 μg·d-1，d1-d35；多西紫杉醇10 mg·kg-1·3d-1，d1-d19。先重組人血管內(nèi)皮抑素組為重組人血管內(nèi)皮抑素400 μg·d-1，d1-d35；多西紫杉醇10 mg·kg-1·3d-1，d16-d34。模型組為生理鹽水100 μL·d-1，d1-d35；注射用水200 μL·3d-1，d1-d35。所有小鼠均于第35天處死、收獲瘤塊。

將瘤塊浸泡于10%福爾馬林進(jìn)行固定，隨后制成蠟塊，切片4 μm厚，用于免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry, IHC）。

1.2.4 療效評(píng)價(jià)方法 測(cè)量瘤塊長(zhǎng)徑a及短徑b、2/w，計(jì)算瘤體積：V=（a×b2）/2，抑瘤率=（1-治療組體積/模型組體積）×100%。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色方法 采用Envision兩步法檢測(cè)各指標(biāo)的表達(dá)：常規(guī)脫蠟至水，高溫、高壓修復(fù)3 min，3%H2O2避光孵育15 min，加一抗（工作濃度為1:150），4oC過夜。二抗37oC孵育30 min，DAB顯色，復(fù)染核，中性樹膠封片。

結(jié)果判定：每張切片于高倍鏡（×400）下隨機(jī)選取8個(gè)-10個(gè)不重復(fù)的視野采集圖像，使用Image Pro Plus 6.0分析圖片，得到每張圖片的積分光密度值（integrated optical density, IOD），取平均值作為該切片的IOD（平均光密度和面積的乘積，可以全面反映蛋白表達(dá)量）。采用泛內(nèi)皮標(biāo)記物CD34標(biāo)記血管并計(jì)算MVD，于鏡下（×400）選3個(gè)血管最豐富的視野計(jì)數(shù)，取其均數(shù)，厚壁血管及直徑較大者（＞8個(gè)紅細(xì)胞直徑）不計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以Mean±SD表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析方法（ANOVA）中的LSD法；不符合正態(tài)分布的資料以中位數(shù)表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U法。符合正態(tài)分布的雙變量間的相關(guān)分析采用Pearson法，不符合正態(tài)分布的采用Spearman法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 第一階段（單藥）

2.1.1 腫瘤生長(zhǎng)及MVD比較 兩組瘤體積與MVD間差異均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.087, P=0.435），但多西紫杉醇組腫瘤體積小于重組人血管內(nèi)皮抑素組，MVD高于重組人血管內(nèi)皮抑素組（圖1，表1）。

2.1.2 各免疫組化指標(biāo)比較 重組人血管內(nèi)皮抑素組MMP-2、EMMPRIN表達(dá)低于多西紫杉醇組（P=0.024,P=0.081），兩組間TIMP-2表達(dá)未見明顯差異（圖2，表2）。

2.2 第二階段（聯(lián)合用藥）

2.2.1 腫瘤生長(zhǎng)比較 治療結(jié)束后兩用藥組腫瘤體積均小于模型組（P＜0.01），兩用藥組間比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.175）。治療第18天至第29天內(nèi)，同時(shí)用藥組腫瘤體積均明顯小于先重組人血管內(nèi)皮抑素組（P＜0.05），其早期抑制腫瘤生長(zhǎng)作用更明顯（圖3，表3）。

2.2.2 各組免疫組化指標(biāo)比較 兩用藥組的MMP-2表達(dá)及MVD顯著低于模型組（P＜0.05），兩用藥組間比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；同時(shí)用藥組TIMP-2表達(dá)較先重組人血管內(nèi)皮抑素組及模型組高（P=0.003, P=0.001），EMMPRIN表達(dá)較模型組低（P=0.018）。先重組人血管內(nèi)皮抑素組TIMP-2、EMMPRIN表達(dá)與模型組比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表4，圖4）。

表 1 重組人血管內(nèi)皮抑素組與多西紫杉醇組的瘤體積、MVD比較Tab 1 The comparison of tumor volume and MVD between the endostar group and the docetaxel group (Mean±SD, M)

表 2 兩單藥組MMP-2、TIMP-2、EMMPRIN表達(dá)情況比較Tab 2 The comparison of the expression of MMP-2, TIMP-2, EMMPRIN between single-drug groups

表 3 同時(shí)用藥組、先重組人血管內(nèi)皮抑素組與模型組治療前、后瘤體積變化比較Tab 3 Comparison of the changes of tumor volume during therapy among the concurrent administration group, endo-first group and model group (Mean±SD, n=8)

表 4 同時(shí)用藥組、先重組人血管內(nèi)皮抑素組、模型組移植瘤的各組化指標(biāo)染色結(jié)果比較Tab 4 Comparison of the dyeing result among concurrent administration group, endo-first group, and model group (Mean±SD, n=8)

圖 1 重組人血管內(nèi)皮抑素組與多西紫杉醇組t移i植me瘤生長(zhǎng)曲線Fig 1 Growth curves of transplanted tumor of Rh-endostatin group and docetaxel group

圖 2 重組人血管內(nèi)皮抑素組與多西紫杉醇組MMP-2、TIMP-2、EMMPRIN表達(dá)（IHC, ×400）Fig 2 The expressions of MMP-2, TIMP-2, EMMPRIN in the endostar group and docetaxel group (IHC, ×400). A, B, C:MMP-2, TIMP-2, EMMPRIN expression of the Rh-endostatin group in turns； D, E, F: MMP-2, TIMP-2, EMMPRIN expression of the docetaxel group in turns.

圖 3 同時(shí)用藥組、先重組人血管內(nèi)t皮i抑m素e組、模型組的移植瘤生長(zhǎng)曲線Fig 3 Growth curves of transplanted lung tumor of the concurrent administration group, endo-first group and model group

2.3 相關(guān)分析 瘤體積與MVD呈明顯正相關(guān)（r=0.529,P=0.017），TIMP-2與腫瘤體積呈負(fù)相關(guān)（r=-0.558,P=0.015）。

3 討論

研究[2]證實(shí)，抗血管生成與化療藥物聯(lián)合治療肺癌可以取得良好療效，故常將以上兩種藥物聯(lián)合使用。但如何找到二者的最佳搭配模式仍是爭(zhēng)論熱點(diǎn)。Huang等[3]認(rèn)為，抗血管生成藥物可將原本排列混亂的腫瘤血管網(wǎng)“梳理整齊”，暢通血流，令更多藥物和氧進(jìn)入，提高腫瘤對(duì)藥物的敏感性。據(jù)此“血管正?；奔僬f，最佳次序應(yīng)為抗血管生成先于化療。但有些研究人員認(rèn)為，“血管正常化”僅僅是一個(gè)短暫過程，不能對(duì)療效產(chǎn)生重大影響；反之，先使用化療大量殺傷腫瘤后再行抗血管生成治療才可帶來最大臨床受益。目前以此模式完成的Avastin與化療聯(lián)合治療肺癌的試驗(yàn)即獲得了滿意效果[2]。因此，亟需比較兩種模式的不同療效，并闡明機(jī)制，為確立最佳治療方案提供依據(jù)。

MMPs是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與腫瘤侵襲關(guān)系最為密切的一類蛋白水解酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）、增加毛細(xì)血管通透性，促進(jìn)液體滲入組織間、壓迫毛細(xì)血管、使其逐漸膨脹、迂曲，血管網(wǎng)排列也變得混亂。故在諸多血管生成因子中，其與“血管混亂化”的關(guān)系最為密切。理論上講，抑制其表達(dá)或功能最可能將原本混亂的腫瘤血管重新排列“正常化”。

圖 4 同時(shí)用藥組、先重組人血管內(nèi)皮抑素組和模型組各染色指標(biāo)表達(dá)情況比較（IHC, ×400）。1-4依次為MMP-2、TIMP-2、EMMPRIN及MVD表達(dá)情況；A：同時(shí)用藥組；B：先重組人血管內(nèi)皮抑素組；C：模型組。Fig 4 The comparison of the expression of each staining index among concurrent administration group, endo-first group, and model group (IHC, ×400). 1-4 were the expression of MMP-2, TIMP-2, EMMPRIN and MVD in turns； A: Concurrent administration group； B: Endo-first group； C: Model group.

MMPs的表達(dá)受其抑制劑TIMPs（matrix metalloproteinase inhibitors, TIMPs）及誘導(dǎo)劑EMMPRIN的調(diào)節(jié)。MMP-2屬于IV型膠原酶，在肺癌組織的表達(dá)明顯高于正常肺組織[4]，其抑制因子TIMP-2是一種非糖蛋白，與MMP-2的親和力很強(qiáng)，主要抑制其活性，但對(duì)MMPs家族其它成員也有作用。ECM的降解并不是由MMPs分泌的多少來決定，而是由MMPs/TIMPs的平衡決定[5]。MMP-2的誘導(dǎo)因子EMMPRIN（extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN）又稱CD147，能誘導(dǎo)MMPs產(chǎn)生[6]、與腫瘤血管生成有密切關(guān)系[7,8]。

Kim等[9]發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮抑素可與MMP-2前體蛋白（pro-MMP2）結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合體而阻止其活化、并抑制MMP-2和膜型MMP（MT1-MMP）的催化活性。也有研究[10]發(fā)現(xiàn)，重組人血管內(nèi)皮抑素對(duì)MMP-2的抑制作用比對(duì)MMP-9的明顯，可能是通過抑制ERK1/2磷酸化引起MMPs下調(diào)。多西紫杉醇也可明顯抑制MMP-2[11]。

重組人血管內(nèi)皮抑素由我國(guó)自主研發(fā)，其III、IV期臨床試驗(yàn)均證明它對(duì)化療藥物有明顯的增效作用。我們選用其和多西紫杉醇進(jìn)行藥物干預(yù)，旨在比較二者的抗腫瘤特點(diǎn)，闡明聯(lián)合用藥時(shí)的最佳順序及分子機(jī)制，為制定臨床治療方案提供依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)第一階段比較兩藥的各自效應(yīng)，結(jié)果重組人血管內(nèi)皮抑素組MMP-2、EMMPRIN表達(dá)低于多西紫杉醇組（P=0.024, P=0.081），雖兩組的瘤體積與MVD間差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.087, P=0.435），多西紫杉醇組腫瘤體積小于重組人血管內(nèi)皮抑素組，MVD卻高于重組人血管內(nèi)皮抑素組；提示盡管前期研究已證實(shí)兩藥均可抑制MMP-2表達(dá)，但重組人血管內(nèi)皮抑素通過下調(diào)EMMPRIN抑制MMP-2表達(dá)的作用更強(qiáng)，并可能更多地降低MVD。但這一“抑瘤潛力”卻未能轉(zhuǎn)化成良好效果、導(dǎo)致瘤體迅速生長(zhǎng)。反之，盡管多西紫杉醇抑制MMP-2的作用可能弱于重組人血管內(nèi)皮抑素，但由于其細(xì)胞毒作用而更有效地抑制了瘤體增大。因此，重組人血管內(nèi)皮抑素抑制新生血管形成的能力雖然更強(qiáng)，但因?qū)δ[瘤細(xì)胞無顯著殺傷、從而不能與化療藥物匹敵并取得良好療效，利用其特點(diǎn)為化療藥物增效應(yīng)更合理。因此，在第二階段觀察了聯(lián)合用藥效果及最佳治療順序。由于在第一階段中重組人血管內(nèi)皮抑素用藥14天后觀察到EMMPRIN、MMP-2明顯下調(diào)，提示已達(dá)到穩(wěn)定抑制MMP的狀態(tài)，因此設(shè)定先重組人血管內(nèi)皮抑素組重組人血管內(nèi)皮抑素單藥的作用時(shí)間為14天。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩聯(lián)合用藥組MMP-2的表達(dá)均低于模型組，但同時(shí)用藥組EMMPRIN表達(dá)明顯低于先重組人血管內(nèi)皮抑素組及模型組，并上調(diào)了TIMP-2表達(dá)，致使MMPs/TIMPs平衡改變、ECM降解減少，有效地降低了腫瘤血管通透性和組織間流體靜壓（interstitial fluid pressure, IFP）、減輕滲出液壓迫微血管、達(dá)到“血管正?；?，使更多藥物進(jìn)入瘤體、為同時(shí)應(yīng)用的化療增效[3]，腫瘤體積也得以明顯縮小。我們推測(cè)，同時(shí)用藥組EMMPRIN和TIMP-2變化應(yīng)歸咎于早期聯(lián)合用藥迅速壓制了腫瘤生長(zhǎng)、使其分泌的腫瘤性促血管生成因子（tumoral angiogenesis factors, TAFs）減少，從而下調(diào)EMMPRIN的表達(dá)而上調(diào)TIMP-2表達(dá)（VEGF可抑制TIMP-2基因及蛋白表達(dá)[12]）。反之，先使用重組人血管內(nèi)皮抑素盡管可能達(dá)到抑制MMP-2表達(dá)、促進(jìn)“血管正?；钡淖饔茫驔]有能有效殺傷腫瘤細(xì)胞的藥物同期通過“正?；钡难苓M(jìn)入瘤體、發(fā)揮功效，致使腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)、產(chǎn)生大量TAFs（如VEGF），全面促進(jìn)腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、活化及新生血管形成、增加血管通透性，這些作用可能部分、甚至全部抵消了MMP下調(diào)對(duì)腫瘤血管的作用，使其恢復(fù)為密集而混亂的狀態(tài)。因此，雖然兩種給藥順序均可通過MMPs環(huán)節(jié)起到抗腫瘤作用，但顯然只有保證兩藥作用緊密銜接，方能充分發(fā)揮重組人血管內(nèi)皮抑素的“增效潛力”。但也可能因?yàn)楸窘M單藥重組人血管內(nèi)皮抑素給藥時(shí)間較長(zhǎng)（14天），導(dǎo)致其作用未能與多西紫杉醇很好銜接而降低了效果。假如找到更合適的重組人血管內(nèi)皮抑素作用時(shí)間窗，緊密銜接兩藥作用，或可達(dá)到更好療效。

本研究從MMPs及其抑制劑、誘導(dǎo)劑的角度探討了兩種用藥順序的不同作用機(jī)制，為臨床用藥提供了一定的理論依據(jù)，也從基礎(chǔ)研究角度驗(yàn)證了在ECOG4599、AVAIL、YH-16等國(guó)內(nèi)、外臨床試驗(yàn)中同時(shí)用藥模式的合理性。但腫瘤生長(zhǎng)是多步驟、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過程，對(duì)其它指標(biāo)、通路的研究有待繼續(xù)進(jìn)行。