張奇 何建行 盧文菊 殷偉強 楊海虹 徐小明 汪道遠

鈣離子（Ca2+）作為細胞內(nèi)第二信使，廣泛參與細胞各種生命活動。細胞內(nèi)Ca2+濃度（[Ca2+]i）調(diào)節(jié)主要依靠：肌漿內(nèi)質網(wǎng)（ER/SR）鈣池系統(tǒng)中Ca2+釋放以及胞外Ca2+通過離子通道如電壓依賴性鈣通道（voltage dependent calcium channels, VDCC）、鈣池操縱性鈣通道（storeoperated calcium channels, SOCC）或受體操縱性鈣通道（receptor-operated calcium channels, ROCC）內(nèi)流[1]。質膜系統(tǒng)鈣離子泵和離子交換蛋白同時參與細胞內(nèi)Ca2+的調(diào)節(jié)，從而平衡著胞漿與細胞器之間的鈣水平。經(jīng)典瞬時受體電位（transient receptor potential canonical, TRPC）通道蛋白為非選擇性陽離子通道家族，包括7個成員，即TRPC1-7。研究表明，TRPC中的部分成員可能參與構成鈣池操縱性鈣通道SOCC，并介導產(chǎn)生鈣池操縱性鈣內(nèi)流（Store-operated calcium entry，SOCE，過去稱CCE）；TRPC介導的SOCE在細胞增殖、遷移和基因轉錄等細胞活動中發(fā)揮重要作用[2]。本研究應用實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR）和蛋白質免疫印跡技術首次檢測了TRPC mRNA和蛋白質在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）組織中的表達情況，并初步分析了TRPC與NSCLC細胞中SOCE的形成可能存在的關系，為進一步開展TRPC的功能研究奠定了分子基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 肺癌組織標本的分離與貯存 標本來自于廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸疾病研究所胸外科于2007年10月-2009年3月間收集的24例病例。所有患者術前未做化療、放療及其它抗腫瘤治療；其中男13例，女11例，中位年齡56.5歲（32歲-79歲）；術后病理確診為NSCLC，病理類型包括：腺癌15例，鱗癌9例。根據(jù)1997年UICC分期包括：Ia期5例，Ib期3例，IIa期2例，IIb期2例，IIIa期8例，IIIb期2例，IV期2例。所有新鮮標本在液氮中凍存。

1.1.2 主要儀器與試劑 iCycler IQ5熒光定量PCR儀以及微型凝膠垂直電泳裝置購自Bio-Rad公司。Trizol試劑盒為Invitrogen公司（美國）產(chǎn)品。逆轉錄采用iScript逆轉錄試劑盒（Bio-Rad公司，美國）。熒光定量PCR試劑使用QuantiTect SYBR Green（Qiagen公司，美國）。引物由TAKARA公司合成。 TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6和β-actin抗體分別購自Alomone公司（以色列）和 Santa cruz公司（美國）。聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）、分子量標準Precision Plus和ECL發(fā)光液采用Bio-Rad公司產(chǎn)品。RIPA組織裂解液購自上海博彩生物公司。Tris、甘氨酸、Tween-20、DTT、BSA等購自Sigma公司（美國）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA抽提 應用Trizol試劑，按公司產(chǎn)品說明書提取總RNA。用TURBO DNA-ゎee 試劑（Ambion公司）除去總RNA樣品中殘留的DNA。紫外分光光度法測定A260nm、A280nm光密度，按公式[RNA]（μg/mL）= 40×稀釋倍數(shù)×A260nm計算RNA濃度；用于本研究的RNA樣品質量要求是，A260與A280比值＞1.8，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳清晰可見28s和18s兩條區(qū)帶，帶型無彌散。

1.2.2 RNA逆轉錄 反應體系體積為20 μL，其中含RNA 1 μg，按iScript逆轉錄試劑盒的說明配制反應體系。逆轉錄條件為：25oC、5 min；42oC、30 min；85oC、5 min。產(chǎn)物在-80oC保存。

1.2.3 熒光實時定量PCR 按QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒要求配制反應體系：PCR反應總體系25 μL，其中含cDNA 1 μL。引物設計采用Primer 3軟件（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi），序列見表1，其中Importin（IPO8）[3]為內(nèi)參基因，用以排除樣本間上樣量的差異。各樣本設置3個復孔，以無模板反應孔為陰性對照，人腦組織cDNA為陽性對照[4]。PCR擴增條件參照文獻[5]：①預變性95oC、15 min；②94oC、15 s，57.5oC、20 s，72oC、20 s，共45個循環(huán)；③95oC、1 min；④55oC、1 min；⑤55oC→95oC Δt0.5oC、10 s。反應產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并送TAKARA公司測序，以驗證擴增產(chǎn)物的長度和序列，以及擴增的特異性。采用陽性對照（人腦組織）CDNA，進行5個梯度的等比稀釋，熒光定量PCR檢測得到各基因引物的標準曲線和擴增效率。

1.2.4 蛋白質免疫印跡分析 ①組織總蛋白的提?。簭?196oC冰箱取出非小細胞肺癌組織及正常肺組織，在冰上迅速研磨成粉末，按每100 mg組織加入1 mL RIPA組織裂解液，冰上孵育30 min；于4oC、12 000 g離心30 min，收集上清液，為提取的總蛋白；②組織總蛋白定量：采用Bradford方法檢測蛋白濃度；③10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：蛋白質于100oC加熱5 min進行熱變性，上樣量為30 μg；④免疫印跡：采用濕法轉膜、5%脫脂奶粉4oC封閉過夜。TRPC一抗進行1:1 000稀釋后孵育膜2 h，二抗按1:5 000稀釋后孵育膜1 h。用ECL發(fā)光液對信號進行檢測。X光片曝光、顯影、定影。實驗以β-actin為上樣內(nèi)參。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計處理 根據(jù)各基因引物效率以及未知樣品的Ct值，采用Pfaffl方法[6]，計算目的基因表達的初始拷貝數(shù)；以IPO8為內(nèi)參，計算各樣本TRPC基因與內(nèi)參基因IPO8的比值，為基因的相對表達量。組間差異的統(tǒng)計學分析采用t檢驗。

2 結果

2.1 熒光定量PCR結果 本研究以Gene Bank中發(fā)表的mRNA序列為模板，分別設計合成了特異性針對人TRPC1-7基因和IPO8內(nèi)參基因mRNA的熒光定量PCR擴增引物。以人腦組織cDNA為陽性對照制作熒光定量PCR標準曲線，經(jīng)反復測定（＞5次），篩選得到擴增效率接近100%、擴增產(chǎn)物的溶解曲線呈現(xiàn)單一峰的一組引物（表1）。另外，擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳見單一條帶且同預計分子量吻合（圖1），經(jīng)測序證實與靶序列匹配率大于99%。

表 1 人TRPC引物信息表Tab 1 Human TRPC primers' sequences and products length

圖 1 人腦組織（陽性對照）TRPC和IPO8熒光定量PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結果。采用所設計的引物（表1）分別檢測到TRPC1-7和IPO8在人腦組織中的表達。電泳顯示各基因擴增產(chǎn)物條帶單一、大小與預期分子量一致，表明引物特異性好。Fig 1 Agarose gel electrophoresis of TRPC and IPO8 qPCR products. Human brain cDNA was used as the positive control to validate the specificity of TRPC1-7 and IPO8 qPCR primers. Agarose gel electrophoresis indicated a single band with expected size of each qPCR product (TRPC1-7 and IPO8).

應用這些引物，對24例NSCLC患者癌組織中的TRPC進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)（圖2）：NSCLC組織中高表達TRPC1和TRPC6，少量表達TRPC3和TRPC4，統(tǒng)計學分析顯示各基因的相對表達豐度為TRPC1≈TRPC6＞TRPC3＞TRPC4，其中TRPC3和TRPC4的表達量分別約為TRPC1的1/8和1/25（兩兩均值之比，P=0.000 4）；在NSCLC組織中未檢測到TRPC2、TRPC5和TRPC7 mRNA的表達。

2.2 TRPC蛋白質免疫印跡結果 以β-actin為內(nèi)參蛋白，對NSCLC組織中mRNA水平有表達的TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6基因，應用免疫印跡方法驗證了其蛋白質的表達，結果表明NSCLC組織表達TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6 通道蛋白（圖3）。

3 討論

細胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)平衡與細胞維持正常的生命活動有密切的關系。在生理條件下，SOCC介導的SOCE是非興奮細胞產(chǎn)生鈣離子內(nèi)流、維持細胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)平衡的重要途徑之一：細胞外激動劑作用于G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor, GPCR）產(chǎn)生三磷酸肌醇（inositol triphosphate, IP3），IP3與鈣池上受體結合后受體開放并迅速釋放Ca2+入胞漿，鈣池出現(xiàn)鈣損耗，效應蛋白感受鈣池損耗狀態(tài)并將信號傳遞給位于細胞膜的SOCC，后者活化開放引起細胞外Ca2+迅速內(nèi)流形成SOCE[7]。目前，關于TRPC成員在構成SOCC、介導產(chǎn)生SOCE中的作用雖然仍有爭議，但越來越多的研究[2,8]發(fā)現(xiàn)，TRPC1、TRPC4和TRPC6在多種不同類型細胞均具有SOCC的功能，比如：在增生的人肺動脈平滑肌細胞，TRPC1表達增加、SOCE增強，經(jīng)TRPC1反義寡核苷酸處理后，人肺動脈平滑肌細胞增殖和SOCE均受到抑制[9]；在TRPC4基因敲除小鼠血管內(nèi)皮細胞上記錄的SOCE要比TRPC4野生型小鼠低[10]；應用TRPC6反義寡核甘酸能夠降低大鼠肺動脈平滑肌細胞表達TRPC6，血小板源性生長因子刺激的SOCE同時受到抑制[11]；TRPC3在低表達時可能參與構成SOCC，但大多數(shù)研究[12]認為TRPC3不具有SOCC的功能。病理條件下，SOCE可能發(fā)生變化并參與疾病的病理機制[5,9,13]。

圖 2 TRPC mRNAAA在 NSCLC組織中的表達譜及表達豐度。熒BB 光定量PCR檢測到NSCLC組織表達TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6 mRNA，未檢測到TRPC2、TRPC5或TRPC7 mRNA的表達；其中TRPC mRNA相對表達豐度為：TRPC1≈TRPC6＞TRPC3＞TRPC4。A：NSCLC組織高表達TRPC1和TRPC6；B：TRPC3和TRPC4在NSCLC組織中呈較低水平低表達，其表達量分別為TRPC1的1/8和1/25（P=0.000 4）；未檢測到TRPC2、5或7的表達。Fig 2 Expression profile of TRPC mRNA in NSCLC tissue. TRPC1, TRPC3, TRPC4 and 6 mRNA were detected in NSCLC tissues by real-time qPCR. TRPC2, TRPC5 and TRPC7 mRNA were not detectable； the relative abundance of TRPC mRNA was TRPC1≈TRPC6 ＞TRPC3＞TRPC4. A: TRPC1 and TRPC6 mRNA were highly expressed in NSCLC tissue； B: The expression of TRPC3 and TRPC4 in NSCLC was relatively low, which was about 1/8 and 1/25 comparing to TRPC1(P=0.000 4)； TRPC2, TRPC5 and TRPC7 mRNA were not detectable.

圖 3 免疫印跡法檢測NSCLC組織中TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6的表達。蛋白質免疫印跡顯示TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6蛋白條帶，β-actin為上樣內(nèi)參蛋白，免疫雜交信號強度均一，表明NSCLC組織中表達TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6通道蛋白。圖中所示為取自3例不同NSCLC組織的代表性數(shù)據(jù)。Fig 3 Detection of TRPC1, TRPC 3, TRPC 4 and TRPC 6 protein expression in NSCLC tissue by Western blot. Representative data of Western blot from 3 different patients indicate TRPC1, TRPC 3, TRPC 4 and TRPC 6 proteins were expressed in NSCLC tissue.β-actin was used as loading control.

多項腫瘤研究表明，前列腺癌[14,15]表達TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6蛋白，僅TRPC1和TRPC4參與SOCE，引起腫瘤細胞異常增殖和生長；肝癌[16]中可檢測到TRPC1和TRPC6，TRPC6介導的SOCE與細胞的惡性增殖有關；TRPC3的表達對卵巢癌[17]的發(fā)展有促進作用；胃[18]及食道癌[19]表達TRPC6，乳腺癌[20]則表達TRPC3和TRPC6，其表達與細胞增殖有關；而基底細胞癌[21]不表達TRPC1和TRPC4，缺乏IP3誘發(fā)的SOCE，阻礙腫瘤細胞向正常分化?？梢?，TRPC1和/或TRPC6與大多數(shù)腫瘤關系密切。

關于肺癌組織中TRPC的表達、SOCC構成情況、是否存在SOCE異常以及與腫瘤的關系，目前還未有報道。本研究首先探討了NSCLC組織中TRPC的表達情況，結果表明，NSCLC組織表達TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6 mRNA和蛋白質，并未檢測到TRPC2、TRPC5和TRPC7基因的表達。進一步分析發(fā)現(xiàn)，TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6 mRNA在NSCLC組織中的表達豐度不同，TRPC1和TRPC6高表達，而TRPC3和TRPC4表達豐度遠遠低于前者。研究[22]表明，SOCC是TRPC通道蛋白以同源或異源方式形成的四聚體通道，NSCLC組織中TRPC的這種表達豐度或許同SOCC的組成方式有關，因此推測，NSCLC的SOCC可能主要由TRPC1和/或TRPC6構成，TRPC3[12]和TRPC4并不主要參與或不參與構成SOCC。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)了NSCLC組織中TRPC的表達譜和相對表達豐度，這些TRPC通道蛋白在NSCLC組織中對癌細胞SOCE的貢獻及與肺癌進展的關系還有待進一步研究。