石冰濤,劉 錦

(1.河南職工醫(yī)學(xué)院人體結(jié)構(gòu)教研室,河南鄭州 451191;2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室,河南鄭州 450052)

hSAMP32基因疫苗的構(gòu)建及對小鼠生育的影響

石冰濤1,劉 錦2

(1.河南職工醫(yī)學(xué)院人體結(jié)構(gòu)教研室,河南鄭州 451191;2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室,河南鄭州 450052)

目的 構(gòu)建 hSAMP32避孕疫苗,研究其對小鼠生育率的影響。方法 擴(kuò)增 hSAMP32基因片段;hSAMP32基因測序;重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-hSAMP32的構(gòu)建;觀察 BALB/c小鼠生殖能力是否受到影響。結(jié)果 經(jīng)對比,目的基因組較對照組穿卵率明顯下降。結(jié)論 hSAMP32基因可以降低BALB/c小鼠的生殖能力。

hSAMP32;基因槍;pcDNA3.1(+);PGEX-4T3;基因疫苗;RT-PCR

精子膜抗原是精子發(fā)生成熟過程中的重要標(biāo)志分子,與受精和胚胎的早期發(fā)育有密切聯(lián)系,具體涉及精子獲能、精卵識別、頂體反應(yīng)、穿過卵透明帶、精卵融合和受精卵的分裂等方面,其中某些抗原能引起機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體,導(dǎo)致免疫性不孕。開發(fā)基于精子膜抗原的避孕疫苗是一條有活力也很有前途的生育調(diào)節(jié)途徑[1-2]。hSAMP32在精卵結(jié)合及融合中發(fā)揮重要作用,是導(dǎo)致免疫不孕的眾多原因之一,諸多研究表明 hSAMP32適合避孕疫苗的研究[3-6]。該實(shí)驗(yàn)是通過構(gòu)建 hSAMP32避孕疫苗,觀察其對小鼠生育率的影響。

1 方 法

1.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-

Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)擴(kuò)增 hSAMP32基因片段 根據(jù) GenBank(AF203447)報(bào)道的hSAMP32基因序列設(shè)計(jì)一對引物,在引物的 5’端加上 BamH I和 XhoI酶切位點(diǎn),以便插入 pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體。提取人睪丸組織總 RNA,逆轉(zhuǎn)錄 cDNA,PCR擴(kuò)增目的基因片段。

1.2 hSAMP32基因測序 瓊脂糖電泳,回收目的條帶,同 T載體連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TG1菌株,氨芐青霉素(Amp)和藍(lán)白斑篩選。挑選白色菌落,進(jìn)行菌落 PCR鑒定和雙酶切鑒定,送 TaKaRa公司測序。

1.3 重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-hSAMP32的構(gòu)建將克隆至 PGEM-T載體的 hSAMP32基因片段用BamH I和 XhoI雙酶切后,連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中,PCR及雙酶切鑒定。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 用基因槍技術(shù)把重組質(zhì)粒 pcD-NA3.1(+)-hSAMP32導(dǎo)入 BALB/c小鼠股四頭肌部位,觀察BALB/c小鼠生殖能力是否受到影響。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增片段電泳結(jié)果 PCR擴(kuò)增出一條 882bp條帶,測序結(jié)果與 GenBank(AF203447)報(bào)道的基因序列一致,見圖 1。

圖1 RT-PCR結(jié)果

2.2 pcDNA3.1(+)-hSAMP32重組質(zhì)粒鑒定 雙酶切產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖電泳后,在Marker 882bp對應(yīng)處出現(xiàn)目的條帶,見圖 2。

圖2

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) hSAMP32目的基因組 BALB/c小鼠 2次基因槍轟擊后妊娠率與對照組相比明顯下降,同時(shí)用鼠抗 hSAMP32血清做穿卵實(shí)驗(yàn)明顯降低精子穿卵率。

表1 酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

鼠抗 hSAMP32血清和 PGEX-4T3-hSAMP32表達(dá)蛋白做酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn),可見隨基因槍轟擊次數(shù)的增加,小鼠血清內(nèi)抗體的滴度隨之增加。

表2 穿卵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)對比目的基因組較對照組穿卵率明顯下降。

表3 生殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

第2次基因槍轟擊后第4周雄鼠合籠,觀察小鼠受孕情況計(jì)算妊娠率,妊娠率 =妊娠數(shù)∕每組雌鼠數(shù) ×100%,經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)目的基因組生育率明顯下降。

3 討論

該實(shí)驗(yàn)用基因槍注射 BALB/c小鼠后,用鼠抗hSAMP32血清做酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)和正常血清組對比發(fā)現(xiàn):hSAMP32組 BALB/c小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了針對hSAMP32抗體,而且其濃度隨基因槍轟擊次數(shù)的增加而增加?；驑屴Z擊后做小鼠合籠生殖實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)目的基因組生育效果明顯下降。

對于任何用作基因轉(zhuǎn)移的載體,它的安全性都是要首先考慮的。DNA疫苗的載體—質(zhì)粒 DNA骨架,是來源于細(xì)菌的。質(zhì)粒DNA的免疫原性對于免疫反應(yīng)的誘發(fā)是有利的,但是也存在質(zhì)粒DNA的免疫原性會(huì)不會(huì)誘導(dǎo)抗雙鏈 DNA抗體從而引起被免疫動(dòng)物發(fā)生自身免疫性疾病的問題。GirMor[7]等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在 BALB/c小鼠中重復(fù)的 DNA免疫可以引起分泌抗 DNA自身 IgG的 B細(xì)胞數(shù)量增加,但對于血清中自身抗體的水平僅有輕微的影響。

大量的研究表明,質(zhì)粒DNA的這種免疫原性是安全的,重復(fù)免疫并不會(huì)誘導(dǎo)抗雙鏈 DNA抗體,也不會(huì)出現(xiàn)局部或全身性的副作用?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為質(zhì)粒DNA的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移也不會(huì)引起插入突變。一些學(xué)者的研究工作也證明注射質(zhì)粒DNA是安全的,不會(huì)引起質(zhì)粒 DNA向宿主染色體整合和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變。Macgregor[8]等所做的臨床試驗(yàn)工作進(jìn)一步的證實(shí)了DNA疫苗的安全性。

另外一個(gè)需要考慮的問題是質(zhì)粒 DNA的轉(zhuǎn)移會(huì)不會(huì)引起插入突變。Kurth等通過計(jì)算,認(rèn)為由質(zhì)粒DNA整合入基因組DNA引起的突變率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于個(gè)體生命過程中基因組 DNA的自發(fā)突變率。Kanellos[9]等的研究表明注射質(zhì)粒 DNA能夠有效的引起針對質(zhì)粒攜帶的外源基因表達(dá)蛋白的免疫反應(yīng)而不會(huì)引起針對核酸的自身免疫反應(yīng),也不會(huì)引起質(zhì)粒DNA向宿主染色體整合。

該實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒 PGEX-4T3-hSAMP32轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 BL21中加入 IPTG誘導(dǎo)后用 SDSPAGE膠電泳得到了明顯的目的條帶 (59KDa),Western blot分析顯示目的基因有明顯的表達(dá)。真核細(xì)胞基因組在原核細(xì)胞表達(dá)有許多難題,本實(shí)驗(yàn)選用的 hSAMP32在大腸桿菌 BL21(DE3)中的到了明顯的蛋白表達(dá),實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)值可為今后研究避孕提供一定的理論依據(jù)[10-11]。

[1]Naz RK,Sacco A,Singh O,et al.Development of contraceptive vaccines for humans using antigens derived from gametes(spermatozoa and zona pellucida)and hormones(human chorionic gonadotrophin):current status[J].Hum Reprod Update,1995,1(1):1-18.

[2]劉學(xué)高.國產(chǎn)避孕疫苗研究現(xiàn)狀和前景[J].動(dòng)物學(xué)研究,2000,21(1):23-27.

[3]Abou-HailaA,TulsianiDR,etal.Mammalian sper m acrosome:formation,contents,and function[J].Arch Biochem Biophys,2000;379:173–182.

[4]MylesDG,Hyatt H,Primakoff P,et al.Binding of both acrosomeintac and acrosome-reacted guinea pig sperm to the zona pellucida during in vitro fertilization[J].DevBio,l987,121:559-567.

[5]Primakoff P,Woolman-GamerL,Tung KS,et al.Reversible contraceptive effect ofPH-20 immunization in male guinea pigs[J].Biol Reprod.1997,56(5):1142-6.

[6]ZhonglinHao,MichaelJ.Wolkowicz,hSAMP32,atestis-Specific,IsoantigenicSperm,Acrosomal,Membrane-Associated Protein[J].Biology of Reproduction,66,735-744(2002).

[7]Niidome T Kimura M,Chiba T Membrane interaction of synthetic peptides related to the putative fusogenic region of PH-30 alpha,a protein isperm-egg fusion[J].J Pept Res.1997 Jun,49(6):563-9.

[8]MacGregor RR,Boyer JD,Ugen KE,et al.Firsthuman trial of DNA-based vaccine for treatment of human immunod eficiency virus type 1 infection:safety and host response[J].JInfect Des,1998,178:92-100.

[9]Kanellos T,Sylvester ID,Howard CR.DNA is as effective as protein at inducing antibody in fish[J].Vaccine.1999,26,17(7-8):965-72.

[10]劉學(xué)高.國產(chǎn)避孕疫苗研究現(xiàn)狀和前景 [J].動(dòng)物學(xué)研究,2000,21(1):23-27.

[11]王浩飛,向祖瓊,王益鑫.精子膜抗原對抗精子抗體陽性精子頂體酶活性的影響[J].中華男科學(xué)雜志,2004.18(2):15-18.

[責(zé)任編校:李宜培]

Vaccine for Sperm Acrosomal Membrane-associated Protein32 and Its Impact on Fertility in Mice

SH IBing-tao1,LIU Jin2
(1.Departm ent of Anatom y,Henan Medical College for Staff and Workers,Zhengzhou Henan451191,China 2.Departm ent of Anatom y,Basic Medical College of Zhengzhou University,Zhengzhou Henan450052,China)

Objective To construct hSAMP32 contraceptive vaccine,and to study its impact on fertility in BALB/c mice.Methods The authors amplified gene hSAMP32,sequeuced hSAMP32 gene,reconstructed DNA vaccine(pcDNA3.1(+)-hSAMP32),using gene-gun to put DNA vaccine into BALB/c mice,and observed the BALB/c mice’s reproductive ability.Results The gravidity rate decreased greatly compared to the control group.Conclusion hSAMP32 can be used as immunocontraceptive vaccine to decrease the rate of pregnancy of mouse.

hSAMP32;gene gun;pcDNA 3.1(+);DNA vaccine;RT-PCR

Q 789

A

1008-9276(2010)06-0637-03

2010-06-10

石冰濤 (1979-),男,河南省鄭州市人,碩士,助教,從事解剖學(xué)教學(xué)與研究工作。