劉心偉,朱文豪,李 何

(1.河南省體育科學(xué)研究所,河南鄭州 450044;2.河南省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所,河南鄭州 450002;3.信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程系,河南信陽(yáng) 464000)

基因克隆技術(shù)研究進(jìn)展

劉心偉1,朱文豪2,李 何3

(1.河南省體育科學(xué)研究所,河南鄭州 450044;2.河南省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所,河南鄭州 450002;3.信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程系,河南信陽(yáng) 464000)

基因克隆;圖位克隆;轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽;表達(dá)序列標(biāo)簽;差異表達(dá)基因

幾種模式生物基因組測(cè)序和人類基因組計(jì)劃(human genome project,HGP)的相繼完成,使人們對(duì)基因的研究很快進(jìn)入后基因組時(shí)代?；蚪M學(xué)時(shí)代的主要任務(wù)是圖譜制作和序列測(cè)定,后基因組學(xué)時(shí)代則是進(jìn)行基因組功能注釋(genome annotation),這也是功能基因組學(xué)的主要研究目標(biāo)[1-2]。如何利用基因這一重要的資源,日益成為研究焦點(diǎn)。關(guān)于基因?qū)＠麢?quán)的建立和完善的基因爭(zhēng)奪大戰(zhàn)的硝煙也正在彌漫全球?？寺』虿粌H可以用來(lái)興旺生命科學(xué)工業(yè) (制藥業(yè)等),改良農(nóng)作物、畜禽品種等,還可以對(duì)遺傳性疾病進(jìn)行基因治療,探索疾病的分子機(jī)制和生物發(fā)育調(diào)控規(guī)律?？寺』虻耐緩接袃煞N,正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)途徑。前者是依據(jù)目標(biāo)基因所表現(xiàn)的功能為基礎(chǔ),通過(guò)鑒定其產(chǎn)物或某種表型突變而進(jìn)行的;后者則著眼于基因本身,通過(guò)特定的序列或在基因組中的位置進(jìn)行?；虻目寺∫话悴捎孟铝屑夹g(shù):同源序列技術(shù)、差異表達(dá)基因分離技術(shù)、表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)、圖位克隆技術(shù)和轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)等。

1 功能性克隆

1.1 通過(guò)基因產(chǎn)物的克隆技術(shù) 在傳統(tǒng)遺傳學(xué)

(正向遺傳學(xué))占主導(dǎo)地位的時(shí)代,人們以基因產(chǎn)物為導(dǎo)向來(lái)分離克隆基因 (功能克隆)。由于基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、功能已知,可通過(guò)分析部分多肽或末端氨基酸序列,反推其核苷酸序列,設(shè)計(jì)探針或引物從基因組DNA文庫(kù)或 cDNA文庫(kù)中篩選克隆,也可以制備產(chǎn)物抗體,從表達(dá)載體構(gòu)建的 cDNA文庫(kù)中篩選相應(yīng)克隆,進(jìn)而分離目的基因。

若研究者可得到足夠多的純化目的蛋白以用于制備特異性抗體時(shí),可以采用經(jīng)典的免疫篩選表達(dá)文庫(kù)的方法,篩選陽(yáng)性克隆獲取其目的基因[3],除了免疫篩選方法外,也可根據(jù)目的蛋白的生物學(xué)功能,利用同位素標(biāo)記的配體來(lái)篩選受體表達(dá)的陽(yáng)性克隆。當(dāng)所分離的目的蛋白較難大量獲得,但純度較高時(shí),可利用其中的一段氨基酸序列,反推出其基因序列,據(jù)此合成寡核苷酸用于 cDNA文庫(kù)的篩選;或根據(jù)所獲得的基因序列,指導(dǎo) 5’端的引物合成,根據(jù) mRNA 3’端 poly-A序列指導(dǎo)合成 poly-T的 3’端引物,用 PCR技術(shù)從制備細(xì)胞的 mRNA或直接從胞漿內(nèi)溶物物中合成相應(yīng)的 cDNA,將該cDNA克隆到表達(dá)載體上進(jìn)行產(chǎn)物表。

1.2 同源性序列克隆技術(shù) 隨著基因研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)幾乎所有的基因與其他的基因都有一定的聯(lián)系:生物的種、屬之間編碼基因序列的同源性高于非編碼區(qū)的序列?；诖嗽?在其他種屬同源基因被克隆的前提下,構(gòu)建 cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù),然后用已知分子高保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,并用簡(jiǎn)并引物對(duì)含有目的基因的 DNA文庫(kù)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,再對(duì) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和功能鑒定。

對(duì)于同源性很高的基因,可以直接用作探針進(jìn)行非嚴(yán)謹(jǐn)性雜交篩選另一物種的 DNA文庫(kù)。如Funkenstein等用紅海鯛和紅鱒魚的生長(zhǎng)激素 (GH)基因的 cDNA篩選 gsb的 cDNA文庫(kù),得到 gsb GH的 cDNA克隆[4]。Almuly等用 gsb GH的 cDNA篩選 gsb的基因組文庫(kù),進(jìn)一步克隆了 gsb GH基因[5]。

同源性序列克隆技術(shù)自提出以來(lái),受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視,發(fā)展很迅速,但有些問(wèn)題是值得重視和思考的:①由于密碼子的簡(jiǎn)并性和不同同源序列間同源程度的差異,簡(jiǎn)并引物的特異性要設(shè)計(jì)得當(dāng),必要時(shí)需要設(shè)計(jì)幾套引物組合。②由于某些同源序列并不專屬于某一基因家族,因而擴(kuò)增產(chǎn)物不一定是某一基因家族成員。③基因家族成員往往成簇存在,克隆的基因片段是否為目的基因尚需進(jìn)一步判斷。因此對(duì) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和克隆產(chǎn)物,有必要進(jìn)行基因與性狀共分離分析,插入失活或遺傳轉(zhuǎn)化等功能鑒定工作,以便最終篩選到目的基因。

2 表型克隆技術(shù)

細(xì)胞在增殖、分化、外界環(huán)境變化等某些異常狀態(tài)下 (如癌變、異常增生),常有某些新基因特異性表達(dá)或表達(dá)異常地增高,而另一些基因可能表達(dá)降低或缺失,因而分離差異表達(dá)基因?qū)⑹钦J(rèn)識(shí)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育等生命活動(dòng)過(guò)程的入手點(diǎn),以此為基礎(chǔ),才能深入理解基因的結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)與調(diào)控。差異表達(dá)基因的分離方法也伴隨分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展由單一化發(fā)展為多元化,而且呈各種方法互相結(jié)合的趨勢(shì)。

分離差異表達(dá)基因的 3種基本方法為:差式篩選 (differential screening)[6]、扣除雜交 (subt ractionhybridization)[7-9]、差異展示反轉(zhuǎn)錄 PCR(differential display reverse t ranscription PCR,DDRTPCR[10])。差式篩選法是分別從有特異表達(dá)基因的目標(biāo)樣 (target sample,TS)和無(wú)特異表達(dá)基因的參照樣 (reference sample)中提取 mRNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并構(gòu)建 TS的 cDNA文庫(kù),分別將從 TS和 RS中提取 mRNA制成 cDNA探針,分別用 TS和 RS的cDNA探針與 TScDNA文庫(kù)的菌落或噬菌斑作原位雜交,選出只與 TS雜交,而不與 RS雜交的克隆即為 TS特異表達(dá)的克隆。此法常要經(jīng)過(guò)多輪菌斑雜交,不僅費(fèi)力費(fèi)錢,重復(fù)性差,而且靈敏度很低?？鄢s交則是用 TS提取的 mRNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA探針與 RS的過(guò)量 mRNA或 cDNA雜交,經(jīng)兩輪充分雜交后,移去雜交分子和過(guò)量的 RS的mRNA或 cDNA,將不形成雜交體的 TS的 cDNA純化富集,擴(kuò)增,建立相應(yīng) cDNA文庫(kù)即為差異表達(dá)基因 cDNA文庫(kù)。但此法回收 cDNA量有限,重復(fù)性差,靈敏度低。DDRT-PCR則是分別用 TS和 RS的總mRNA作模板,利用 12個(gè)可能的錨定引物 T11MN錨定mRNA的 olyA末端,借助逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA第一鏈,得 mRNA/cDNA,再用相同的 3’錨定引物和 5’端隨機(jī)引物分別擴(kuò)增 TS、RS的 mRNA/cDNA,擴(kuò)增產(chǎn)物用序列膠電泳分析差異表達(dá)情況,將差異帶DNA回收,可進(jìn)一步鑒定分析,最終獲得差異表達(dá)基因。它與前二者相比,速度快,易操作,可以鑒定低豐度差異表達(dá)的 mRNA,分析 2種以上樣品基因的差異表達(dá)等優(yōu)點(diǎn),但仍存在假陽(yáng)性率高、重復(fù)性差、擴(kuò)增片段短等問(wèn)題。下面就這些方法的具體過(guò)程作詳細(xì)介紹。

2.1 代表性差示分析法 (RDA) 該法可用于分離與生理?xiàng)l件改變相關(guān)的基因及不同發(fā)育階段差異表達(dá)的基因,具體過(guò)程個(gè)如下:①制備擴(kuò)增子。提取TS和 RS的 mRNA并反轉(zhuǎn)錄制備雙鏈 cDNA即 tester cDNA和 driver cDNA。然后用限制性內(nèi)切酶切,將酶切片段裝上接頭,末端補(bǔ)平后,加入接頭引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。②扣除雜交。去除接頭后僅對(duì) tester片段加上新的接頭,用過(guò)量的 driver cDNA與之雜交退火,將形成三種產(chǎn)物:tester/tester、tester/driver、driver/driver。③特異性片段的擴(kuò)增。末端補(bǔ)平后,加入新接頭引物進(jìn)行 PCR。3種產(chǎn)物中僅自身退火形成的 tester/tester兩端均能和新引物配對(duì)而呈指數(shù)擴(kuò)增,tester/driver僅一端可和新引物配對(duì)而呈線性擴(kuò)增,Driver/driver無(wú)引物配對(duì)不擴(kuò)增。然后用綠豆核酸酶去除單鏈 DNA分子,再進(jìn)行 PCR富集特異表達(dá) cDNA片段。④對(duì)特異片段進(jìn)行克隆,通過(guò) FISH等技術(shù)進(jìn)一步分離特異表達(dá)基因。

2.2 抑制性差減雜交 PCR法 (SSH) SSH的基本流程如下:①第1次雜交。提取 TS和 RS的 mRNA反轉(zhuǎn)錄為 tester cDNA和 driver cDNA,用 Rsa I或HaeⅢ酶切成平頭末端 cDNA,分成均等 2份,分別加不同的接頭,再分別與過(guò)量的 driver cDNA雜交,將形成 4種產(chǎn)物:a,單鏈 tester cDNA、b,自身退火的tester/tester雙鏈、c,異源退火 tester/driver雙鏈、d,drivercDNA。②第2次雜交。合并 2份雜交產(chǎn)物,加入新的變性 driver cDNA退火、雜交,這次除了 a、b、c、d 4種產(chǎn)物外還形成產(chǎn)物 e,e是 tester自身退火形成,但兩端帶不同接頭。③特異性片段的擴(kuò)增。末端補(bǔ)平后,先后加接頭的內(nèi)、外側(cè)引物擴(kuò)增,a和 d無(wú)擴(kuò)增,b由于兩端接頭互補(bǔ)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)也無(wú)擴(kuò)增,c僅一端有引物結(jié)合呈線性擴(kuò)增,僅 e兩端可配不同引物而呈指數(shù)擴(kuò)增。④特異性片段 e克隆,并進(jìn)一步分離差異表達(dá)基因。

該法通過(guò) 2次雜交和 2次 PCR,使假陽(yáng)性率可降到 6%[11],且靈敏度高。用 SSH可一次同時(shí)分離幾十至幾百個(gè)差異基因,效率大增。

2.3 交互差減差異 RNA顯示 (RSDD) RSDD的主要過(guò)程如下:①交互差減。分別提取具有差異表達(dá)的 2種組織細(xì)胞 A、B的 mRNA,反轉(zhuǎn)錄為 cDNA,并構(gòu)建 cDNA文庫(kù)。將這 2個(gè)文庫(kù)進(jìn)行交互差減得到 A減B和 B減 A的 2個(gè)差減 cDNA文庫(kù),由于構(gòu)建文庫(kù)所用的噬菌體載體上帶有質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu),載體進(jìn)入宿主后,其上質(zhì)粒載體被切下,得質(zhì)粒cDNA文庫(kù)。②差異顯示。用 3’錨定引物和 5’隨機(jī)引物對(duì) 2個(gè)差減文庫(kù)提取的 DNA分別進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物用 5%序列膠電泳,顯示并分離差異條帶,回收差異 DNA,再次擴(kuò)增后,獲得富集的差異表達(dá)片段。③表達(dá)分析。采用反向Northern分析和Northern分析鑒定經(jīng)再次擴(kuò)增的差異 DNA片段的真?zhèn)?。反向Northern分析是將差異顯示得到的擴(kuò)增后 DNA片段轉(zhuǎn)膜,分別與來(lái)自 A、B細(xì)胞系的總mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄制備的 32 P標(biāo)記的 cDNA第一條鏈探針進(jìn)行雜交,只與親本來(lái)源細(xì)胞系雜交,而不與另一細(xì)胞系雜交的即為真正差異表達(dá)的基因。④對(duì)差異片段克隆、測(cè)序,并進(jìn)一步分離獲得差異表達(dá)的基因。

RSSD可以有效快速地鑒定由于細(xì)胞生理變化而在基因組中差異表達(dá)的基因,它結(jié)合了 DDRTPCR和扣除雜交的優(yōu)點(diǎn),減少或消除了共有序列,使序列膠上條帶清晰度增加,并使低豐度序列得到富集,降低了假陽(yáng)性率,且 RSDD僅用較少的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 PCR就可分析全部差異表達(dá)基因,但RSSD并不能完全杜絕假陽(yáng)性。Kang等用 RSDD法克隆并證實(shí)了促進(jìn)腫瘤發(fā)展的基因(PEGene)和抑制腫瘤發(fā)展的基因 (PS Gene)[12]。

3 圖位克隆技術(shù)

隨著各種生物分子標(biāo)記連鎖圖的相繼建立和越來(lái)越多的基因被定位,在 90年代初圖位克隆技術(shù)也應(yīng)運(yùn)而生。其原理是根據(jù)功能基因在基因組中存在相對(duì)較穩(wěn)定的基因座,在利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行精確定位的基礎(chǔ)上,用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選 DAN文庫(kù) (如 YAC、BAC或 Cosmid文庫(kù)),構(gòu)建出目的基因區(qū)域的物理圖譜,再通過(guò)染色體步行 (chromosome walking)逐步逼近候選區(qū)域或通過(guò)染色體登陸 (chromosome landing)的方法最終找到包含該目的基因的克隆進(jìn)而克隆該基因。

定位克隆理論上適用于一切基因,但也存在應(yīng)用上的一些不足:如果要構(gòu)建完整的基因組文庫(kù),建立飽和的分子標(biāo)記連鎖圖和完善的遺傳轉(zhuǎn)化體系,對(duì)基因組較大、標(biāo)記數(shù)量不多而重復(fù)序列較多的生物采用此法投資大且效率低,因而圖位克隆技術(shù)目前僅局限于擬南芥、水稻、番茄等圖譜飽和的模式植物上。

4 表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù) (EST)

EST是完整基因上能特異性標(biāo)記基因的一部分序列,通常包含了基因足夠的結(jié)構(gòu)信息區(qū),從而與其他基因相區(qū)分,大規(guī)模 EST克隆和資料庫(kù)的建立,為利用生物信息學(xué)克隆基因提供了條件。其基本原理是從組織特異性或細(xì)胞特異性的 DNA文庫(kù)中隨機(jī)挑選克隆,并進(jìn)行 5’和 3’端部分測(cè)序,通過(guò)對(duì)基因庫(kù)的檢索,可以檢測(cè)所測(cè)序以及翻譯的多肽氨基酸序列與基因庫(kù)中已知的是否有同源性,最后對(duì)發(fā)現(xiàn)的新基因進(jìn)行突變檢測(cè)和表達(dá)分析。基本過(guò)程如下:①對(duì)已知的部分序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)分析,篩選出代表新基因的 EST及相應(yīng)的重疊群,定位信息等,根據(jù)所得信息設(shè)計(jì)引物,制備探針。②用探針進(jìn)行cDNA文庫(kù)篩選,得 cDNA陽(yáng)性克隆,接著用設(shè)計(jì)引物與所得 cDNA陽(yáng)性克隆載體臂進(jìn)行巢式 PCR和5’、3’-RACE,得 5’端和 3’端部分序列 (約 400 bp)。③對(duì)所得陽(yáng)性克隆和末端序列進(jìn)行測(cè)序。④通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)新序列進(jìn)行分析,包括與已知基因的同源性分析、拼接延伸、ORF識(shí)別、結(jié)構(gòu)分析、翻譯蛋白質(zhì)分析等。⑤若第一步有新 EST的定位信息,即可對(duì)基因進(jìn)行定位和結(jié)構(gòu)分析;若無(wú)定位信息,還要篩選基因組文庫(kù),進(jìn)行測(cè)序和 FISH定位等工作。⑥最后對(duì)發(fā)現(xiàn)的新基因進(jìn)行突變檢測(cè)和表達(dá)分析。

該技術(shù)建立在大量已有的生物信息資源基礎(chǔ)上的,同時(shí),結(jié)合了目前的新技術(shù),為大規(guī)?？寺』蛱峁┝私輳?。它不僅可檢測(cè)到許多已知的基因,更可以發(fā)現(xiàn)許多未知的基因。

EST還具有廣泛的用途。利用對(duì)獨(dú)立 EST的拼接可獲得新基因的全長(zhǎng) cDNA序列;利用 EST標(biāo)簽克隆的斑點(diǎn)雜交可鑒定涉及組織或器官發(fā)育過(guò)程不同階段各個(gè)基因表達(dá)的不同,與其他差別雜交方法相比,它能進(jìn)行初步篩選和鑒定,因而節(jié)省了時(shí)間;由于事先獲得了某個(gè)基因的 EST,所以可加速對(duì)該基因的克隆以及序列測(cè)定。

5 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽 (transposon tagging)技術(shù)

轉(zhuǎn)座子是染色體上一段可以移動(dòng)的DNA序列,它可以從一個(gè)基因座位轉(zhuǎn)移到另一個(gè)基因座位,當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到某個(gè)功能基因內(nèi)部或鄰近位點(diǎn)時(shí),就會(huì)使插入位置的基因失活并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型,通過(guò)遺傳分析可以確定某基因的突變是否由轉(zhuǎn)座子引起,由轉(zhuǎn)座子引起的突變可用轉(zhuǎn)座子 DNA為探針,從突變株的基因組文庫(kù)中釣取含該轉(zhuǎn)座子的 DNA片段,獲得含有部分突變株DNA序列的克隆,然后以該DNA序列為探針,篩選野生型植株的基因組文庫(kù),最終得到完整的目的基因。該技術(shù)主要用于植物基因的克隆[13],由于可供利用的轉(zhuǎn)座子的種類太少,而轉(zhuǎn)座子在不同的植物中轉(zhuǎn)座的頻率和活性相差很大,并且需要篩選大量的個(gè)體來(lái)鑒定轉(zhuǎn)座子突變個(gè)體,限制了轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法的應(yīng)用范圍。

基因克隆的技術(shù)發(fā)展很快,種類也越來(lái)越多,但每一種方法都有它的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)及適用范圍和限制因素。綜合來(lái)看,不同的克隆策略,雖主導(dǎo)思路不同,但常常是相互聯(lián)系相互補(bǔ)充的,有些過(guò)程也是共通的,因而實(shí)驗(yàn)者必須根據(jù)所克隆基因的類型和實(shí)際條件選擇最佳的方案。隨著各種知識(shí)的積累,克隆基因的技術(shù)也逐步完善,速度效率也不斷提高,相信人類終將掌握大規(guī)模、快捷、經(jīng)濟(jì)基因克隆的技術(shù),并很快將基因的研究安全地應(yīng)用到實(shí)踐中去。

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[責(zé)任編校:李宜培]

Q 785

B

1008-9276(2010)06-0753-04

2010-06-10

劉心偉 (1983-),男,河南省駐馬店市人,學(xué)士,研究實(shí)習(xí)員,從事運(yùn)動(dòng)員基因選材和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練生理生化監(jiān)控研究。