吳子健，陶琳

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

核黃素結(jié)合蛋白的性質(zhì)及其功能

吳子健，陶琳

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

來自雞的包括雞蛋的核黃素結(jié)合蛋白是單亞基磷酸糖蛋白，能特異性地結(jié)合VB2并將其輸送到胚胎，以維持胚胎的生長發(fā)育。介紹它的種類、分子的組成與結(jié)構(gòu)、結(jié)合核黃素的分子機(jī)理、分子的熱穩(wěn)定性、對鹽酸胍的化學(xué)穩(wěn)定性以及生物學(xué)方面的功能。

核黃素結(jié)合蛋白；結(jié)合核黃素的分子機(jī)理；分子結(jié)構(gòu)

Abstract:Riboflavin-binding protein,a globular monomeric phosphoglycoprotein originated from chicken,is able to specific bind and transport riboflavin to the embryo,sustaining its growth and development until hatching.It is to introduce the categories,composition and structure,molecular riboflavin-binding mechanism,thermal stability,chemical stability under the existence of GdnHCl,and its biological functions.

Key words：riboflavin-binding protein;molecular riboflavin-binding mechanism;molecular structure

雞卵中核黃素結(jié)合蛋白（Riboflavin-binding Protein，RfBP），也稱為黃素蛋白或卵黃素蛋白，是分子量約為29.2 ku的球狀單亞基磷酸糖蛋白，對核黃素（即VB2）具有高度親和力[1]。雞蛋清的淺黃色正是由于該種蛋白特異性結(jié)合核黃素導(dǎo)致的[2]。其含量占整個蛋清蛋白的0.8%，并且在蛋黃和產(chǎn)蛋母雞的血漿中也發(fā)現(xiàn)了該種蛋白[3]。RfBP蛋白能儲存水溶性的VB2并將其輸送到胚胎，用以維持胚胎的生長發(fā)育直到孵化。目前，關(guān)于核黃素結(jié)合蛋白的研究國內(nèi)剛剛開始，綜述國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，介紹該蛋白分子的性質(zhì)。

1 核黃素結(jié)合蛋白的種類

雞核黃素結(jié)合蛋白分為3種，即蛋清核黃素結(jié)合蛋白（Egg-white Riboflavin-binding Protein,wRfBP）、蛋黃核黃素結(jié)合蛋白（Egg-yolk Riboflavin-binding Protein，yRfBP）和雞血清核黃素結(jié)合蛋白（Serum Riboflavin-binding Protein,sRfBP）。3種蛋白氨基酸序列都是由同一基因編碼的，只是經(jīng)歷了不同的翻譯后修飾[2]。wRfBP由輸卵管細(xì)胞合成[4]；sRfBP是由雞的肝臟受雌激素控制下合成的；而yRfBP則是蛋白酶將通過卵母細(xì)胞膜的血漿核黃素結(jié)合蛋白上末端11個～13個氨基酸殘基酶解掉形成的[5]。wRfBP蛋白和sRfBP蛋白擁有同樣的氨基酸殘基序列，不同的是Asn36和Asn147位點(diǎn)的糖基是不同的；目前已知sRfBP蛋白和yRfBP蛋白的糖基一級結(jié)構(gòu)是相同的[6]，而wRfBP蛋白目前只知道其糖基的組成，但糖基一級結(jié)構(gòu)至今鮮見研究報道。

2 核黃素結(jié)合蛋白的組成與結(jié)構(gòu)

WRBP蛋白由219個氨基酸殘基組成[7]，其N-端為焦谷氨酰殘基。在翻譯后修飾過程中，該蛋白分子內(nèi)的8個絲氨酸殘基被磷酸化，2個天冬氨酸殘基被糖基化。1997年，Monaco報道了其高分辨率X-射線晶體結(jié)構(gòu)[1]，明確表明：分子內(nèi)約30%氨基酸殘基參與形成6個α-螺旋（分別被命名為A到F）；約15%氨基酸殘基參與形成了4個β-折疊（分別被命名為a到d）；在這些二級結(jié)構(gòu)中，4個α-螺旋（A到D）和4個β-折疊參與構(gòu)建了蛋白中高親和力的核黃素結(jié)合位點(diǎn)，而剩余的2個α-螺旋則圍繞著186位至197位氨基酸殘基形成的可折疊的高度磷酸化區(qū)域。WRBP蛋白分子的空間大小約為50×40×35 A?（如圖1和圖2所示）。

整個結(jié)構(gòu)可分為2個區(qū)域：（1）一個配基結(jié)合區(qū)域（N-末端至Cys169），該區(qū)域較大，且含有一個寬度約為20 A?、深度為15 A?的裂縫，可容納與之結(jié)合的核黃素；（2）較小的磷酸化motif（從Cys169到C-末端），含有很多帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（8個磷酸絲氨酸殘基和10個谷氨?；鶜埢8]，這些磷酸絲氨酸殘基高度密集形成群簇，如：Ser185-Glu-Ser（P）-Ser（P）-Glu-Glu190-Ser（P）-Ser（P）-Ser（P）-Met-Ser（P）195-Ser（P）-Ser（P）-Ser（P）-Glu-Glu200[9]。該區(qū)域是3種RfBP蛋白都含有的區(qū)域，現(xiàn)在已知這個磷酸化區(qū)域參與了卵母細(xì)胞對PRBP蛋白的吸收，它在PRBP蛋白與卵黃生成素（vitellogenin）相互作用中起到了關(guān)鍵的作用。

這3種RfBP蛋白另一個特點(diǎn)是分子中都含18個半胱氨酸殘基（其中9個半胱氨酸殘基位于無規(guī)則卷曲，7個位于α-螺旋上，2個位于β-折疊上），共形成9個二硫鍵（如表1所示），穩(wěn)定著該蛋白天然的結(jié)構(gòu)[11]，其中8個二硫鍵位于核黃素的結(jié)合區(qū)域，剩下的一個則是負(fù)責(zé)連接兩個結(jié)構(gòu)域。這些二硫鍵在空間上與核黃素之間的相對位置如圖2所示。

表1 雞卵清RfBP蛋白中的二硫鍵[12]Table 1 Disulfide bridges of chicken riboflavin-binding protein

RfBP蛋白中有組成中有14%為糖，分布在2個N-糖基化位點(diǎn)上（即，Asn-36和Asn-147，如圖1所示），主要是巖藻糖，甘露糖，半乳糖，N-乙酰葡糖胺和唾液酸，這2個糖基化位點(diǎn)的周圍5個殘基具有保守性序列（4個為相同氨基酸殘基）；但2個位點(diǎn)的糖基化方式（即類型與分布）卻不同：一般在Asn-147位點(diǎn)結(jié)合的糖具有3到5個支鏈[13]，而Asn-36位點(diǎn)上糖鏈較Asn-147位點(diǎn)的分支少。說明蛋白質(zhì)局部二級、三級結(jié)構(gòu)或糖基化的次序會影響糖基化位點(diǎn)上結(jié)合的寡糖結(jié)構(gòu)（Rohrer and White III 1992）。另一方面wRfBP蛋白結(jié)合的寡糖不同于yRfBP分子結(jié)合的寡糖，是由于這兩種核黃素結(jié)合蛋白是由不同組織合成，且具有不同的功能。

3 RfBP與核黃素的結(jié)合

3.1 核黃素結(jié)合位點(diǎn)

核黃素與脫輔基RfBP蛋白按照1∶1的比例強(qiáng)烈結(jié)合[14]，其解離常數(shù)大約為1.3×10-9M。核黃素由核糖醇鏈和異咯嗪環(huán)組成，其中異咯嗪環(huán)（賦予蛋清淡黃色）具有兩性性質(zhì)：二甲苯部分具有疏水性，嘧啶基團(tuán)部分具親水性[15]?？梢姽夂妥贤饩€的照射會導(dǎo)致核黃素單體轉(zhuǎn)變?yōu)楣恻S素，特別是在堿性的溶液中，但一旦與蛋白質(zhì)結(jié)合，核黃素可在長期激光脈沖的照射下保持穩(wěn)定[16]。RfBP蛋白的核黃素結(jié)合區(qū)域是一個約20 A?寬15A?深的憎水性裂口，含有蛋白質(zhì)中5/6的絲氨酸殘基。核黃素上異咯嗪環(huán)與Trp-156和Tyr-75的芳香環(huán)平面相互平行堆積在一起。圖3清楚地顯示了核黃素分子以及與其結(jié)合接觸的氨基酸殘基側(cè)鏈的電子密度。

并且在RfBP蛋白與核黃素結(jié)合時，異咯嗪環(huán)中憎水性的二甲苯部分深入蛋白的內(nèi)部。核黃素中的異咯嗪與蛋白間的相互作用主要為憎水相互作用。

3.2 二硫鍵對RfBP結(jié)合核黃素的影響

1981年Kozik A[17]利用巰基乙醇或二硫蘇糖醇的還原作用將脫輔基的蛋清RfBP分子中的所有二硫鍵斷開，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋清RfBP分子喪失了結(jié)合核黃素的能力，并且其動力學(xué)和統(tǒng)計分析表明該蛋白分子內(nèi)的任何一個二硫鍵對于蛋白結(jié)合核黃素都是至關(guān)重要的。同時該項(xiàng)研究也表明結(jié)合了維生素的核黃素結(jié)合蛋白復(fù)合體中的二硫鍵較難以被還原斷開，但若被還原，反應(yīng)呈現(xiàn)一級反應(yīng)的規(guī)律。

3.3 RfBP中寡糖對RfBP結(jié)合核黃素的影響

1981年Miller等在溫和條件下酸解和乳糖氧化酶去除RfBP中的唾液酸，利用來自黑曲霉的各種糖苷酶混合物去除RfBP中的N-乙酰氨基葡糖和乳糖，然后對比研究發(fā)現(xiàn)去除了糖基的RfBP分子對于核黃素結(jié)合的能力低于天然分子的能力。說明去除糖鏈會致使其與核黃素集合能力的下降。

3.4 pH值對RfBP結(jié)合核黃素的影響

pH值對于RfBP與核黃素的結(jié)合影響較大：通常pH值在4.5與9之間，核黃素與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密；但當(dāng)pH低于4.0時，兩者的結(jié)合常數(shù)會迅速下降：核黃素與RfBP解離，形成脫輔基蛋白與游離的核黃素[18]。當(dāng)pH＞4.5時，核黃素結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)象是固定的,但pH＜4.0時，圓二色譜法檢測表明其芳香族氨基酸側(cè)鏈的遷移率，分子體積，分子表面，蛋白質(zhì)的水化作用均有顯著的變化，同時各向異性也會降低。酸性pH值可誘導(dǎo)的核黃素結(jié)合位點(diǎn)的酪氨酸和色氨酸芳香環(huán)重新定向，從而導(dǎo)致蛋白中富含芳香族氨基酸殘基的裂口部位張開并釋放核黃素。在pH值較低時，提高RfBP蛋白溶液的離子強(qiáng)度會顯著增加解離常數(shù)，但是在中性pH值時，卻不會。

4 RfBP的穩(wěn)定性

4.1 RfBP分子的熱穩(wěn)定性

2000年Marcin Wasylewski利用示差掃描量熱法技術(shù)測定了蛋清RfBP分子熱力學(xué)折疊的各種參數(shù)，考察了含輔基的RfBP分子以及不含輔基的RfBP分子的熱變性參數(shù)，發(fā)現(xiàn)[19]：RfBP蛋白的熱穩(wěn)定性高，不含輔基的RfBP分子的變性溫度為60.8℃，且結(jié)合核黃素會增強(qiáng)其熱穩(wěn)定性，變性溫度可直接提高到72.8℃。在2004年Marcin Wasylewski進(jìn)一步研究證明[20]：蛋白分子中的9個二硫鍵會使RfBP分子形成緊湊的結(jié)構(gòu)，并且使其分子熱變性過程可逆，通常其熱變性過程分為2個獨(dú)立的進(jìn)程，而這一特點(diǎn)與該蛋白中存在2個獨(dú)立的結(jié)構(gòu)區(qū)域（N-端核黃素結(jié)合區(qū)域、C-端磷酸化區(qū)域）有關(guān)，在被加熱時，2個結(jié)構(gòu)區(qū)域會依次打開折疊而伸展；N-端核黃素結(jié)合區(qū)域比C-端磷酸化區(qū)域的變性溫度要低；同時配基結(jié)合會大大提高N-端區(qū)域的熱穩(wěn)定性，而對C-端區(qū)域的熱穩(wěn)定性影響輕微。

4.2 化學(xué)變性

若利用鹽酸胍對RfBP進(jìn)行化學(xué)變性，當(dāng)鹽酸胍的濃度從0 mol/L變化到6 mol/L時，天然RfBP有兩個打開分子重疊而伸展的階段[21]。當(dāng)鹽酸胍濃度從0 mol/L到2 mol/L時，RfBP蛋白失去一些三級結(jié)構(gòu)，在鹽酸胍濃度在2 mol/L到4 mol/L時，RfBP蛋白分子成為穩(wěn)定的中間態(tài)，當(dāng)鹽酸胍濃度在4 mol/L到6 mol/L時，該蛋白分子完全變性并且失去其二級結(jié)構(gòu)。由于憎水性裂口的坍塌，當(dāng)鹽酸胍濃度為3 mol/L時，所有的核黃素分子都會從蛋白的分子上解離下來（Zhong and Zewail 2001）。只要9個二硫鍵存在，在變性劑去除后，變性的RfBP蛋白會很快重新折疊。如果RfBP蛋白事先被還原過，正確的二硫鍵不會立即重新形成，該蛋白也就會喪失其結(jié)合核黃素的能力[22]。

5 RfBP蛋白的功能

5.1 輸送VB2供雞胚胎發(fā)育[1]

RfBP蛋白最主要的生物學(xué)功能是儲存水溶性的VB2并將其輸送到胚胎，以維持胚胎的生長發(fā)育直到孵化。禽蛋中RfBP的量在其他營養(yǎng)載體蛋白中是相對充足的，因?yàn)楹它S素對于胚胎的正常發(fā)育至關(guān)重要。1992年White III HB等研究表明：缺乏RfBP的產(chǎn)蛋母雞所下的受精蛋是無法成為能夠存活的胚胎，缺乏核黃素的雞蛋形成的胚胎會在孵育約13 d左右而死亡。這主要是由于在孵化13 d時，恰逢黃素激酶活性大大增加，這是一種利用核黃素合成FMN、FAD的酶。

5.2 抗菌作用[23]

RfBP在蛋清中可以充當(dāng)核黃素的吞噬者，可消除游離的核黃素，從而抑制需要利用核黃素作為營養(yǎng)的微生物的生長，從而保護(hù)雞胚胎不受細(xì)菌侵害。

5.3 選擇性的甜味抑制劑和苦味抑制劑[24-25]

2007年Kenji Maehas等的研究表明蛋清RfBP分子可以選擇性地抑制蛋白類甜味劑的甜味，諸如：竹芋蛋白、莫尼糖蛋白和溶菌酶等，但是無法抑制小分子的甜味劑的甜度，諸如：蔗糖、甘氨酸、D-苯丙氨酸、糊精、環(huán)氨酸鹽、阿斯巴甜和甜菊糖等。2008年該研究組還揭示：蛋清RfBP還可以作為苦味抑制劑，抑制諸如：鹽酸喹啉、柚（皮）苷、可可堿、咖啡因、Gly-Phe和苯甲地那銨等物質(zhì)的苦味。因此RfBP蛋白也許可用于降低食品或藥物的苦味。

6 展望

目前人們對于蛋清RfBP蛋白結(jié)構(gòu)與功能、其與核黃素結(jié)合過程關(guān)系等有了較為深入的了解，特別是其可選擇性地抑制蛋白類甜味劑的甜味并抑制苦味，該蛋白可有助于揭示甜味蛋白物質(zhì)、苦味物質(zhì)結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系以及人類甜味和苦味感知的機(jī)理。

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Properties and Functions of Riboflavin-binding Protein Originated from Chicken

WU Zi-jian,TAO Lin
（School of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology,Tianjin 300134,China）

2010-06-11

吳子?。?973—），男（漢），副教授，碩士，研究方向：生物活性物質(zhì)提取與應(yīng)用。