孫艷華，張智禹，牛晉陽，李韡，喬建軍，*

（1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津300072;2.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津300070;3.北京市肉類食品監(jiān)督局，北京100068）

PCR法快速檢測熟肉制品中肉類來源

孫艷華1,2，張智禹1，牛晉陽3，李韡1，喬建軍1，*

（1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津300072;2.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津300070;3.北京市肉類食品監(jiān)督局，北京100068）

應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)進行熟肉制品種類來源的快速檢測是目前市場監(jiān)控方面的空白。通過查閱國內(nèi)外的相關(guān)文獻，同時進行基因序列的比對，確定針對市場上常見肉類豬、牛、羊、雞的特異性線粒體序列的引物。經(jīng)過多次重復(fù)試驗證明，所選定的引物只有在同一種屬模板DNA存在的情況下才會發(fā)生PCR擴增，特異性強，靈敏度高。建立的方法僅需20 mg的樣品，而樣品中含有1 mg的待檢肉類就可以被檢出。

熟肉制品；肉類來源；PCR；線粒體DNA

Abstract：It is still empty for rapid detecting meat source from commercial processed meat by using molecular methods.By referring to many literatures and comparing the gene sequences,the characteristic primers for different meat species including sus scrofa,bos taurus,ovis aries,gallus gallus were determined in this paper.By several rounds of experiments,the results of verifications suggested they have high species specificity and can satisfy the requests of accurate detection.Only 20 mg sample was needed for detecting and 1mg meat source in sample could be detected in this paper.

Key words：processed meat;source of meat;PCR;mitochondrial DNA

肉制品市場中，一些單位和個人為了追求自身利益而以雞肉冒充豬肉，以豬肉冒充牛羊肉等，用低價劣質(zhì)的肉冒充高價優(yōu)質(zhì)的肉，極大的損壞了消費者的利益和健康[1]。目前，質(zhì)監(jiān)部門主要是通過肉制品的味道、色澤、肉類的紋理等進行肉類來源的判別工作，這些傳統(tǒng)鑒別方法對于市場上假冒生肉的鑒別起到了非常重要的作用[2]。但是，對于很多熟肉制品（如香腸）來說，加入的肉經(jīng)過了粉碎處理，并且添加香料掩蓋了原有的味道，傳統(tǒng)的方法難以進行準確的肉類來源鑒定。

目前，市場上經(jīng)過加工的熟肉制品質(zhì)量難以鑒定，國家及地方各級質(zhì)監(jiān)部門急需要一種分析食品中的肉類來源的方法能夠快速，有效的對肉類來源進行檢測。分析食品中的肉類來源的方法主要有兩種：應(yīng)用抗體特異性的ELISA法和基于核酸特異性的PCR法[3-4]。由于肉制品加工過程中蛋白質(zhì)容易變性，導(dǎo)致ELISA法鑒定肉類來源的穩(wěn)定性和可靠性較差。而在食品加工過程中，部分DNA不會被破壞，所以利用PCR方法檢測食物中肉類成分是切實可行的方法，該法可以不受肉類高溫加工的影響。另外，PCR法具有特異性強、操作簡單、靈敏度高的特點，建立的方法由于成本低，也易于快速推廣[5]。

基于PCR方法檢測飼料和生肉制品中的肉類來源已經(jīng)得到了較多的關(guān)注和研究。1998年，Tartaglia等根據(jù)牛線粒體 DNA中的 tRNA3’端、ATPase8和ATPase6的氨基酸片段，設(shè)計了特異引物用于檢測反芻動物飼料中牛源性成分，建立的方法的檢測靈敏度可以達到0.125%[6]。2000年，Montiel-Sosa JF等建立了基于PCR技術(shù)的檢測肉制品來源的方法，主要用來檢測食品中是否有豬肉或豬油[7]。2001年，Lahiff等建立了檢測飼料中綿羊、豬和雞成分的DNA方法，用于反芻動物成分的檢測，并且在此基礎(chǔ)之上建立了定量PCR分析方法[8-9]。Tajima K等采用分散重復(fù)序列（SINE）設(shè)計了牛、綿羊和山羊的擴增引物，該引物對以上3種動物成分的檢測靈敏度達0.01%[10]。2007年，Tanabe S等采用定量PCR的方法分析食物中豬、雞、牛、羊及馬肉來源，并且可以實現(xiàn)較為準確的定量[11]。

國內(nèi)陳穎等在檢測保健品中牛羊源性成分的過程中使用了PCR方法，所設(shè)計的特異性引物對牛成分檢測低限為0.05%，甚至可以擴增含有0.005%的山羊成分的樣品[12]。楊寶華等應(yīng)用線粒體DNA的特異性建立分析飼料中蛋白牛羊來源的PCR方法[13]。

通過不同肉類來源的線粒體基因比對，并且查閱國內(nèi)外的相關(guān)文獻，確定針對豬、牛、羊、雞線粒體基因的特異性引物。應(yīng)用PCR技術(shù)進行熟肉制品的肉類來源檢測，多次試驗證明，建立的方法取樣少，所選引物特異性強、靈敏度高。通過對市場上的一些熟肉制品進行隨機檢測，結(jié)果表明大多數(shù)正規(guī)廠家的熟肉制品的肉類來源基本可靠，只有少數(shù)小攤販的肉類有造假情況。

1 設(shè)備與試劑

1.1 試劑與材料

TIANGEN核酸抽提試劑盒、DNA marker（標準分子）、EB（溴化乙錠）染色液、TapDNA酶、PCR試劑盒等均購置北京市天根生物技術(shù)有限公司。

1.2 待檢測樣品

試驗中在引物特異性驗證過程中和對市場上肉類制品進行檢測時用到的豬肉、雞肉、牛肉、羊肉、火腿腸、香腸及某超市自制的豬肉火腿均從天津超市獲得。

1.3 PCR引物的確定

結(jié)合現(xiàn)有文獻結(jié)果，通過分析和比對常見肉類的mtDNA的保守序列，確定了針對不同動物線粒體DNA的特定片段，分別設(shè)計不同種屬動物引物，見表1。

2 方法

2.1 樣品中DNA的提取

將所有樣品液氮充分研磨備用，取10 mg～20 mg樣品用 200 μL TE 懸浮，加入 400 μL 裂解液（5 mol/L CuSCN；0.05 mol/L Tris-HCl，pH6.4；0.02 mol/L EDTA，pH8.0；1.3%TritonX-100），70 ℃溫浴 10 min,加等量氯仿混勻，離心（10000 r/min，5 min），取上層水相，加等量冰乙醇－20℃沉淀 10 min，離心（10000 r/min，5 min），棄上清，用70%乙醇洗滌一次，晾干，用50 μL TE溶解沉淀。-20℃下保存待用。另外，也可以采用染色體DNA提取試劑盒來提取樣品的全部DNA。

2.2 PCR試驗

將設(shè)計好的引物分別與提取到的熟豬肉、熟牛肉、熟羊肉、熟雞肉DNA進行PCR擴增反應(yīng)，并對產(chǎn)物進行檢測。具體方法如下。

以牛肉DNA與各引物的反應(yīng)為例。取牛DNA等量加入4個100 μL無菌PCR管中，分別加入牛引物、豬引物、雞引物和羊引物（正向和反向引物均相等）。在每個PCR管中加入適量含TapDNA酶，dNTPs等的2×master，然后再加入無菌雙蒸水稀釋。將反應(yīng)體系放入PCR儀中，設(shè)定不同的變性、退火和延伸時間和溫度。一般反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)如表2所示。

表1 不同種屬動物的引物Table 1 Primers of different animal species

表2 PCR檢測方法的循環(huán)參數(shù)Table 2 Rameter of PCR method

根據(jù)引物，模板及反應(yīng)體系的不同在具體PCR過程中，循環(huán)參數(shù)會有輕微的波動。反應(yīng)完畢后將PCR產(chǎn)物取出，利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測分析。

3 結(jié)果

3.1 引物特異性檢測

建立用PCR方法檢測熟肉制品中肉類來源的方法，需要對合成的引物進行驗證，檢測其是否可以通過PCR擴增獲得目標條帶，同時也需要分析引物的特異性和靈敏度，檢測其能否滿足檢測的需要。提取豬、牛、羊、雞的染色體，分別用豬、牛、羊、雞的引物進行PCR，電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1（a）為豬、羊染色體分別與豬、羊引物的PCR擴增結(jié)果，圖（b）為豬、羊、雞染色體與不同引物的PCR擴增結(jié)果，圖（c）為牛染色體與不同引物反應(yīng)的檢測結(jié)果。

以豬染色體為模板，豬、牛、羊、雞4種引物為探針進行PCR，擴增結(jié)果表明：豬引物與豬染色體可發(fā)生PCR擴增（圖1-a條帶2），而豬染色體與其他3種引物均不能擴增得到目標DNA片段（圖1-a條帶4；圖1-b條帶1,2）。

以羊染色體為模板，豬、牛、羊、雞4種引物為探針進行PCR，擴增結(jié)果表明：羊染色體與羊引物可發(fā)生PCR擴增（圖1-a條帶5，7），而羊染色體與其他3種引物均不能擴增得到目標DNA片段（圖1-a條帶6；圖 1-b 條帶 3，4）。

以雞染色體為模板，豬、牛、羊、雞4種引物為探針進行PCR，擴增結(jié)果表明：雞染色體與雞引物可發(fā)生PCR擴增（圖1-b條帶5），而雞染色體與其他3種引物均不能擴增得到目標DNA片段（圖1-b條帶6，7，8）。

圖（c）是針對牛染色體的特異性檢測。檢測結(jié)果可以看出，4種引物中只有牛引物能夠以牛染色體為模板發(fā)生PCR擴增（圖1-c條帶1），而其他種屬的引物則不能擴增得到目標DNA條帶（圖1-c條帶2,3,4）。

以上結(jié)果都說明所設(shè)計的豬、牛、羊和雞引物只有在同源DNA為模板的情況下能夠發(fā)生PCR擴增，而不與非同源的DNA發(fā)生反應(yīng)，各引物都具有良好的種屬特異性。同時，試驗中豬染色體含量僅為原有10%時仍然可以獲得清楚的檢測條帶（圖1-a條帶3），表明此檢測方法的靈敏度至少可以達到10%，檢測樣品為2 mg。另外可以通過染色體DNA濃縮技術(shù)進一步提高檢測的靈敏度。

3.2 隨機檢測市場熟肉制品的結(jié)果

應(yīng)用PCR方法檢測熟肉制品的特異性好，可以檢測到肉類中含量高于10%的造假肉類。購買了正規(guī)超市和市場中的10種熟肉制品，用合成的特異引物進行PCR檢測，測定結(jié)果表明：大多數(shù)品牌熟肉制品中的肉類來源與標簽中的注明相符。

對某超市自制豬肉制品為陽性對照，提取20 mg樣品中的DNA進行PCR擴增，得到了陽性結(jié)果（圖2條帶3），說明此肉制品中確實有一定含量的豬源性成分存在。對A品牌的低端豬肉火腿和某超市自制肉質(zhì)制品進行檢測，結(jié)果如圖2所示，A品牌豬肉火腿（豬、雞、鴨混合型）雖然成分中標明含有豬肉成分，但提取的染色體與豬引物進行PCR，卻檢測不到擴增產(chǎn)物的存在。模板取樣增大10倍（條帶4）后才可以觀察到微弱亮帶，表明此混合火腿中豬肉的含量極少。

4 結(jié)論

通過比對豬、牛、羊、雞的線粒體基因組序列，確定了針對4種常見肉類的特異性檢測引物。試驗證明，獲得的引物具有特異性強、靈敏度高的特點，建立的PCR檢測方法樣品用量少、結(jié)果準確，適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。

由于目前相關(guān)法律法規(guī)沒有明確規(guī)定，要求市場上的肉類制品標示出所含肉類的種類及含量，所以市售的肉制品均只標明成分而不標明各成分含量。在這種情況下，對肉制品中不同種屬的肉類進行定量檢測意義不大，故本試驗中所使用的引物其特異性和靈敏度完全符合市場檢測的要求。如果未來的實際應(yīng)用中需要對肉制品的肉類含量進行定量，可以在本文研究基礎(chǔ)上開發(fā)定量PCR技術(shù)，盡管檢測成本高，還是可以實現(xiàn)檢測的定量化。另外，利用DNA濃縮方法可以進一步提高檢測靈敏度，從而實現(xiàn)極微量肉類來源的檢測。由于檢測極微量肉類來源的實際應(yīng)用性較低，本文沒有添加應(yīng)用DNA濃縮后提高檢測靈敏度的試驗結(jié)果。同時，基于本文中的PCR方法也可以用于檢測食品加工過程中的微生物污染問題[14-15]，同樣也是食品安全檢測的熱點問題。

[1]吳信法.肉的假冒和肉制品摻雜的檢驗[J].肉品衛(wèi)生，2002(4):30

[2]林世武,李學(xué)花.羊肉和豬肉的快速鑒定方法[J].肉品衛(wèi)生，2002，(9)：36

[3]彩鴻翔，魯曉翠，李彬彬，等.酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用研究進展[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，11(6)：67-69

[4]Wang R F，Myers M J，Campbell W，et al.A rapid method for PCR detection of bovine materials in animal feedstuffs[J].Molecular and Cellular Probes，2000,14(1):1-5

[5]Erlich H A，Gelfand D，Sninsky J J.Recent advances in the PCR[J].Science，1991，252(5013)：l643-1651

[6]Tartaglia M，Saulle E，Pestalozza S,et al.Detection of bovine mitochondrial DNA in ruminant feeds：a molecular approach to test for the presence of bovine-derived materials[J].Journal of Food Protection，1998,61(5):513-518

[7]Montiel-Sosa J F,Ruiz-Pesini E,Montoya J,et al.Direct and highly species-specific detection of pork meat and fat in meat products by PCR amplification of mitochondrial DNA[J].J Agric Food Chem,2000,48(7):2829-2832

[8]Lahiff S,Glennon M O B L,Lyng J,et al.Species specific PCR for the identification of ovine,porcine and chicken species in meta and bone meal(MBM)[J].Molecular and cellular probes,2001,15(1):27-35

[9]Lahiff S，Glennon M，Lyng J,et al.Real－time polemerase chain reaction detection of Bovine DNA in meat and bone meal samples[J].Journal of Food Protection,2002，65(7)：1158-1165

[10]Tajima K.PCR detection of DNAs of animal origin in feed by primers based on sequences of short and long interspersed repetitive elements[J].Biosci Biotechnol Biochem,2002,66(10):2247-2250

[11]Tanabe S,Hase M,Yano T,et al.A real-time quantitative PCR detection method for pork,chicken,beef,mutton and horseflesh in foods[J].Biosci Biotechnol Biochem,2007,71(12):3131-3135

[12]陳穎，吳亞君，徐寶梁，等.進出口動物源性產(chǎn)品中牛羊成分的檢測方法[J].食品工業(yè)科技,2004,25(8):143-145

[13]楊寶華，宗卉，林慶燕，等.用分子生物學(xué)方法鑒別檢測動物源性飼料中的牛羊源性成分[J].中國畜牧雜志,2002,38(1):3-5

[14]Aguado V，Vitas A L，Garcia-Jalon.Random amplified polymorphic DNA typing applied to the studies of cross-contamination by Listeria monocytogenesin processed food products[J].Food Protection,2001,64(5):7l6-720

[15]Fach P，Dilasser F，Grout J，et al.Evaluation of PCR based test for detecting salmonella spp in food sample：Probelia Salmonella spp[J].Food Protection,1999,62(12):1387-1393

Rapid Detecting Meat Source in Cooked Meat by PCR Method

SUN Yan-hua1,2,ZHANG Zhi-yu1,NIU Jin-yang3,LI Wei1,QIAO Jian-jun1,*
（1.School of Chemical Engineering＆ Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2.School of Basic Medical Science，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；3.China Meat Research Centre，Beijing 100068，China）

2009-11-23

北京市自然科學(xué)基金（6092011）

孫艷華（1972—），女（漢），副教授，在職博士研究生，研究方向：生物檢測。

*通訊作者:喬建軍（1973—），男（漢），副教授，博士后，研究方向：生物制藥。