吳華昌,徐靜,鄧靜,張偉娜

(四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川自貢,643000)

透明質(zhì)酸的變溫發(fā)酵研究＊

吳華昌,徐靜,鄧靜,張偉娜

(四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川自貢,643000)

采用獸疫鏈球菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,研究了30～40℃范圍內(nèi)溫度對透明質(zhì)酸(HA)分批發(fā)酵的影響,結(jié)果表明:34℃時菌體量最大為13.1 g/L,38℃下HA的產(chǎn)量最高為82 mg/100 mL;在此基礎(chǔ)上,提出分階段控制溫度策略,通過L18(37)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出的最優(yōu)變溫發(fā)酵條件是:發(fā)酵前期控制溫度在34℃,進(jìn)入穩(wěn)定期12 h時,改變發(fā)酵溫度至40℃,在此變溫條件下發(fā)酵HA的產(chǎn)量可達(dá)105.3 mg/100 mL,比38℃恒溫發(fā)酵提高了28.4%。

透明質(zhì)酸,變溫發(fā)酵,獸疫鏈球菌

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,簡稱HA),作為一種國際上公認(rèn)的生物大分子保濕劑,在醫(yī)藥,化妝品,保健食品等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[1-3],其需求量也在不斷增加。HA的生產(chǎn)主要有組織提取法和細(xì)菌發(fā)酵法,發(fā)酵法由于原料易得,成本低,有較高的分子量和產(chǎn)量,而逐漸成為生產(chǎn)HA的主要方向,并開展了許多研究工作[4]。

溫度對發(fā)酵過程的影響是多方面的,主要是影響各種酶反應(yīng)的速率,影響微生物代謝調(diào)控機(jī)制,改變菌體代謝產(chǎn)物的合成方向以及影響發(fā)酵液的理化性質(zhì),進(jìn)而影響發(fā)酵的動力學(xué)特性及產(chǎn)物的生物合成[5]。一般而言,最適發(fā)酵溫度是既適合菌體生長,又適合代謝產(chǎn)物合成的溫度,但最適生長溫度與最適產(chǎn)物合成溫度往往是不一致的[6-7]。本文在前人研究的基礎(chǔ)上,首先考察了不同溫度對HA分批發(fā)酵的影響,確定出最適菌體生長溫度和產(chǎn)物形成溫度;在此基礎(chǔ)上又提出了變溫發(fā)酵,即在生長階段選擇最適生長溫度,以利于菌體迅速生長繁殖,在產(chǎn)物生成階段選擇最適生產(chǎn)溫度,以利于產(chǎn)物形成,從而達(dá)到高生產(chǎn)強(qiáng)度,高產(chǎn)率和高產(chǎn)量的相對統(tǒng)一。

1 材料與方法

1.1 菌種

獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidem icus)原始菌株,四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:葡萄糖1 g,蛋白胨0.5 g,KH2PO40.1 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,瓊脂1.5 g,水100 mL,pH 7.0,121℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖2 g,酵母膏2.5 g,KH2PO40.1 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,MnSO4·4 H2O 0.01 g,水100 mL pH 7.0,121℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(%):葡萄糖2,蛋白胨1,酵母膏0.5,KH2PO40.2,MgSO4·7H2O 0.05,pH 7.5,121℃滅菌30 min。

1.3 培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng):將保藏菌種接入試管斜面培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng),37.5℃培養(yǎng)15 h。

種子培養(yǎng):用5 mL無菌水洗試管斜面,菌液接入搖瓶種,裝液量為40 mL/250 mL,在200 r/min,37℃條件下培養(yǎng)12 h。

恒溫發(fā)酵:裝液量為75 mL/500 mL的搖瓶中,接種量1 mL,用搖床在200 r/min,不同溫度(30、32、34、36、38、40℃)下培養(yǎng)20 h,其中每隔2h取樣測值。

變溫發(fā)酵:裝液量為75 mL/500 mL,接種量1 mL,200 r/min下培養(yǎng)20 h,發(fā)酵過程中用2個搖床實(shí)現(xiàn)溫度的變化。

1.4 分析方法

葡萄糖的測定:DNS法[8],菌體的測定:干重法[9],HA的測定:Bitter-Muir法[10]

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對HA分批發(fā)酵的影響

在不同溫度下進(jìn)行恒溫發(fā)酵,每隔2 h取樣測定發(fā)酵液中葡萄糖濃度,菌體干重和HA的含量,結(jié)果如圖1～圖3。

圖1 不同溫度下葡萄糖的消耗曲線

圖2 不同溫度下細(xì)胞生長曲線

圖3 不同溫度下HA的生物合成過程曲線

由圖1知,30℃下,殘?zhí)堑臐舛容^高,其他發(fā)酵溫度下隨著溫度的升高,葡萄糖進(jìn)入快速消耗期的時間提前,而且殘?zhí)呛苌?葡萄糖基本被利用,葡萄糖濃度由最初的2.5%降至0.3%左右。

由圖2知,30～40℃,菌體生長曲線良好,有明顯的延滯期,對數(shù)生長期和穩(wěn)定期,隨著溫度的提高,菌體生長的延滯期縮短,進(jìn)入對數(shù)生長期和穩(wěn)定期的時間提前。30～34℃,16 h時進(jìn)入穩(wěn)定期,36～40℃內(nèi)12 h進(jìn)入穩(wěn)定期,提前了4 h左右。由穩(wěn)定期內(nèi)各溫度的菌體干重知34℃是菌體的最適生長溫度,菌體量可達(dá)13 g/L。

由圖3知,HA的合成曲線與菌體生長曲線偶聯(lián),在30～36℃內(nèi),隨著溫度的提高,HA的產(chǎn)量在增加。38℃下發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期之前HA的產(chǎn)量不高,但進(jìn)入穩(wěn)定期之后,HA的產(chǎn)量明顯提高。38℃時HA的產(chǎn)量最高為82 mg/100 mL,可能是因?yàn)樵谳^高溫度下,菌體莢膜上的HA更容易脫落,所以產(chǎn)量有所提高。此時HA對葡萄糖的產(chǎn)量系數(shù)轉(zhuǎn)化率為34.36 mg/g,生產(chǎn)強(qiáng)度為3.90 mg/(100 mL·h)。

2.2 HA變溫發(fā)酵條件的確定

以HA產(chǎn)量為指標(biāo),采用正交試驗(yàn)對發(fā)酵過程中變溫前的溫度(A),變溫時間(B),變溫后的溫度(C)3個因素的3個水平進(jìn)行考察。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平設(shè)計表

變溫前的溫度,變溫時間和變溫后的溫度這3個因素又相互有影響,就要考慮它們之間的交互作用,試驗(yàn)中就以HA的產(chǎn)量為指標(biāo),用L18(37)正交試驗(yàn)設(shè)計進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析表

續(xù)表2

由因素的影響主次可知,變溫時間對變溫發(fā)酵的影響最大,根據(jù)指標(biāo)越大越好,可以得到優(yōu)方案為A3B2C2,即變溫前的溫度為34℃,變溫時間是12 h,變溫后的溫度為40℃,即表2中的8號實(shí)驗(yàn),在該條件下HA的含量達(dá)105.30 mg/100 mL,比38℃恒溫發(fā)酵產(chǎn)量提高了28.4%,此時HA的產(chǎn)率系數(shù)為46.39 mg/g,其生產(chǎn)強(qiáng)度為5.27 mg/(100 mL·h)。

以HA為主要指標(biāo),用SPSS軟件對表2的結(jié)果進(jìn)行方差分析,估計各因素對試驗(yàn)結(jié)果影響的重要程度,結(jié)果如表3所示。

表3 方差分析表

由方差分析表不僅可以看出各因素的影響主次,根據(jù)F值還可以判斷出各因素影響的顯著性,變溫時間對試驗(yàn)的影響非常顯著,變溫前后的溫度對結(jié)果的影響顯著,交互作用的影響較小。

在最佳變溫條件優(yōu)方案A3B2C2下進(jìn)行HA變溫發(fā)酵,變溫發(fā)酵過程中葡萄糖的消耗,菌體的生長和HA的產(chǎn)生情況如圖4。

圖4 分段控制溫度條件下發(fā)酵過程曲線

由圖4中HA的生成曲線可以看出,在發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期(12 h)后,改變發(fā)酵溫度HA的產(chǎn)量有了明顯的提高,因?yàn)榘l(fā)酵前期溫度控制在菌體的最適生長溫度34℃上,前期菌體生長狀態(tài)良好,12 h后改變發(fā)酵溫度至40℃,不僅可以促進(jìn)莢膜多糖的脫落,而且HA的溶解度增大,也利于HA的產(chǎn)生。

將圖1到圖4的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,得到不同溫度下HA分批發(fā)酵過程參數(shù),如表4所示。

由表4知,在整個發(fā)酵過程中,溫度對不同參數(shù)的影響是不同的,甚至是相反的。在恒溫發(fā)酵過程中,細(xì)胞平均比生長速率在34℃時達(dá)到最大為0.181/h,同時細(xì)胞生產(chǎn)強(qiáng)度和產(chǎn)率系數(shù)也是最大,HA平均比合成速率在38℃時達(dá)到最大為6.2 mg/(g·h),此時的HA生產(chǎn)強(qiáng)度和產(chǎn)率系數(shù)也最大。變溫發(fā)酵與恒溫發(fā)酵相比,HA的產(chǎn)量,生產(chǎn)強(qiáng)度和產(chǎn)率系數(shù)都比38℃恒溫發(fā)酵提高了25%左右,由此可見在HA發(fā)酵過程中采用變溫發(fā)酵能更好的實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量,生產(chǎn)強(qiáng)度和產(chǎn)率系數(shù)的統(tǒng)一。

表4 不同溫度下HA分批發(fā)酵過程參數(shù)比較

3 結(jié)論

在Streptococcus zooepidem icus分批發(fā)酵生產(chǎn)HA過程中,相對較低的溫度34℃下可以促進(jìn)細(xì)胞生長,菌體濃度可達(dá)13.1 g/L,此時菌體對葡萄糖的產(chǎn)量系數(shù)為0.58 g/g,而較高溫度38℃下HA的產(chǎn)量更高,為82.00 mg/100 mL,生產(chǎn)強(qiáng)度為4.10 mg/(100 mL·h),HA對葡萄糖的產(chǎn)量系數(shù)為34.36 mg/g,主要是因?yàn)樵谳^高溫度下,更多的莢膜多糖脫落,產(chǎn)量提高。通過溫度對HA發(fā)酵的影響可知,在整個發(fā)酵過程中控制單一的溫度很難實(shí)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞生長和增加HA合成的統(tǒng)一。

在以生長為主的階段,選擇最適生長溫度,以利于菌體迅速生長繁殖,而在產(chǎn)物合成階段,選擇較高溫度促進(jìn)莢膜脫落,產(chǎn)物生成,由此提出了分階段控制發(fā)酵溫度的策略。通過正交試驗(yàn)確定出最優(yōu)的變溫發(fā)酵條件是:控制發(fā)酵前期溫度為34℃,發(fā)酵至12 h時,改變發(fā)酵溫度到40℃,此時HA的產(chǎn)量為105.30 mg/100 mL,比38℃恒溫發(fā)酵提高了28.4%,此時HA的產(chǎn)率系數(shù)為46.4 mg/g,其生產(chǎn)強(qiáng)度為5.3 mg/(100 mL·h),由此可見變溫發(fā)酵過程中生產(chǎn)強(qiáng)度,產(chǎn)率和產(chǎn)量有有所提高,本文提出的分階段控制溫度進(jìn)行變溫發(fā)酵是有效的。

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ABSTRACTHA batch fermentation process usingStreptococcus zooepidem icuswas discussed under different temperatureswhich were varied from 30℃to 40℃,the results show that the optimal bacterial growth temperature is 34℃and the highest yield up to 82mg/100mL at 38℃.Application of a two-stage temperature control strategy was developed base on those studies.The orthogonal ofL18(37)indicated thatwhen pre-fermentation temperature was controlled at 34℃and changed to 40℃in product synthesis phase,the yield of HA increased to 105.30 mg/100 mL,which is 28.4%higher compared to that of fermentation at single temperature of 38℃.

Key wordshyaluronic acid,variable-temperature fer mentation,Streptococcus zooepidem icus

Application of a Two-Stage Temperature Control Strategy for HA Batch Fermentation Process

Wu Hua-chang,Xu Jing,Deng Jing,ZhangWei-na
(Bio-Engineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China)

碩士,副教授。

＊四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(No.2006J13-169)

2009-11-16