楊偉東

（寶雞文理學(xué)院，陜西寶雞721007）

固定化β-甘露聚糖酶制備甘露低聚糖的研究

楊偉東

（寶雞文理學(xué)院，陜西寶雞721007）

研究用固定化β-甘露聚糖酶水解魔芋精粉制備甘露低聚糖的工藝。試驗(yàn)結(jié)果表明反應(yīng)時(shí)間、魔芋精粉濃度、溫度及加酶量對(duì)甘露低聚糖的制備有一定影響，其中魔芋精粉濃度和加酶量影響較大，反應(yīng)溫度影響較小。通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化出的固定化β-甘露聚糖酶制備甘露低聚糖的最佳工藝條件為：魔芋精粉濃度2%；加酶量為6400 U；反應(yīng)溫度70℃；反應(yīng)時(shí)間17 h。在此條件下甘露低聚糖的得率為30.8%。

甘露低聚糖；固定化β-甘露聚糖酶；魔芋精粉

Abstract:The process conditions of Mannan-Oligosaccharides is studied by this paper,that produced by Immobilized β-mannanase.Experimental results show that the reaction time,konjac flour concentration,temperature and the amount of Immobilized β-mannanase on the Mannan-oligosaccharides have some influence,it is most influence that konjac flour concentration and time of reaction,but temperature was less.The orthogonal test results show when time was 17 h,temperature was 70℃,concentration of konjac flour was 2%,and amount of Immobilized β-mannanase was 6400 U.The synthesis of galacto-oligosaccharide amount was 30.8%.

Key words：mannan-Oligosaccharides;immobilized β-mannanase;konjac flour

甘露低聚糖是近年來(lái)國(guó)際上頗為流行的一種新型功能性低聚糖，它是由2個(gè)～10個(gè)甘露糖通過(guò)糖苷鍵連接形成主鏈，再在主鏈上連接葡萄糖或半乳糖的雜聚寡糖。它能有效促進(jìn)人體內(nèi)有益細(xì)菌雙歧桿菌的生長(zhǎng)繁殖，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增強(qiáng)人體免疫力等多種功能[1]。由于游離酶的價(jià)格很高,為了節(jié)約成本,用固定化酶來(lái)生產(chǎn)甘露低聚糖具有許多游離酶無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)[2-4]。例如反應(yīng)后酶可以重復(fù)回收使用,可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn),并且易于制成各種各樣的生物反應(yīng)器,因此得到廣泛的利用。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

黑曲霉β-甘露聚糖酶：陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院食品分析實(shí)驗(yàn)室制備；魔芋精粉：武漢清江魔芋制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 固定化β-甘露聚糖酶的制備

用0.5%的乙酸溶液配制1.5%的殼聚糖溶膠,并將其涂抹在60目～100目的層析硅膠上。再用戊二醛對(duì)硅膠—?dú)ぞ厶穷w粒進(jìn)行化學(xué)修飾,交聯(lián)3h后徹底水洗至洗脫液中沒(méi)有戊二醛,然后加入β-甘露聚糖酶于冰浴中攪拌1 h后,放入冰箱中4℃吸附過(guò)夜。次日用蒸餾水徹底水洗,過(guò)濾干燥,即得到固定化β-甘露聚糖酶[5-8]。

1.2.2 DNS試劑的配制

酒石酸鉀鈉18.2 g，溶于50 mL蒸餾水中，加熱，于熱溶液中依次加入3，5-二硝基水楊酸0.03 g，NaOH 2.1 g，苯酚0.5 g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至100 mL，貯于棕色瓶中，室溫保存。

1.2.3 固定化酶活力測(cè)定

固定化酶活力的測(cè)定方法：將10 mL用pH=5.8的緩沖溶液配制的0.3%的魔芋精粉底物于75℃的水浴中預(yù)熱10 min,然后加入0.3 g的固定化酶準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后,從中吸取1 mL反應(yīng)液，然后加入3 mL DNS試劑于沸水浴中加熱5 min后比色。

1.2.4 甘露低聚糖的制備

配制一定pH值的磷酸緩沖溶液，置于150 mL帶塞錐形瓶中，加入一定量的魔芋精粉，預(yù)熱后加入一定量的固定化β-甘露聚糖酶，在一定溫度的恒溫?fù)u床中反應(yīng)一段時(shí)間，取樣，用薄層色譜法檢測(cè)各糖組分的含量。

1.2.5 甘露低聚糖的檢測(cè)

采用上行的薄層色譜法，以硅膠G作薄板，正丙醇∶水（體積比）=85∶15 為展開(kāi)劑，點(diǎn)樣量為 0.2 μg/μL，用苯胺-二苯胺-磷酸溶液噴霧后于110℃加熱下顯色10 min，用直接測(cè)定法檢測(cè)各糖組分含量。

1.2.6 單因素試驗(yàn)

按照甘露低聚糖的制備方法，以甘露低聚糖得率為考察指標(biāo)，依次進(jìn)行了7個(gè)乳清粉濃度：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%；8個(gè)反應(yīng)溫度：55、60、65、70、75、80、85、90 ℃；8 個(gè) pH 值：3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0；7 個(gè)酶用量：1280、2560、3840、5120、6400、7680，8960 U；17 個(gè)反應(yīng)時(shí)間(h)的單因素試驗(yàn)。每個(gè)水平重復(fù)3次，測(cè)定結(jié)果取平均值。

1.2.7 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以甘露低聚糖得率為考察指標(biāo)，選擇反應(yīng)溫度、魔芋精粉濃度、酶添加量和反應(yīng)時(shí)間，設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)L9（34），進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果取其平均值，通過(guò)極差分析和試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化固定化酶法制備甘露低聚糖的最佳工藝條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)甘露低聚糖得率的影響

在反應(yīng)溫度60℃、乳清粉濃度3%、pH5.8、固定化酶用量6400 U時(shí)，研究了不同的反應(yīng)時(shí)間對(duì)甘露低聚糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知：當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于15 h時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，葡甘露低聚糖得率逐漸增加；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于15 h時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，葡甘露低聚糖得率反而逐漸減小。這是因?yàn)楫?dāng)反應(yīng)時(shí)間小于15 h時(shí)，β-甘露聚糖酶隨機(jī)降解糖苷鍵，葡聚糖分子被分解成各種糖類，隨著時(shí)間的增加甘露低聚糖得率逐漸增加。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于15 h時(shí)，隨著時(shí)間的增加，甘露低聚糖分子被分解成單糖。

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)甘露低聚糖的影響

在反應(yīng)時(shí)間為15 h，乳清粉濃度3%、pH5.8、固定化酶用量6400 U時(shí)，研究了不同反應(yīng)溫度下固定化酶法制備甘露低聚糖的反應(yīng)歷程，結(jié)果如圖2所示。

圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)甘露低聚糖得率的影響Fig.1 The effect of reactive time on yield of Mannan-Oligosaccharides

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)甘露低聚糖得率的影響Fig.2 The effect of the amount of enzyme activity on Mannanoligosaccharides

如圖2可知，當(dāng)溫度小于70℃時(shí)，隨著溫度的升高，甘露低聚糖的得率逐漸增加，說(shuō)明溫度升高有利于糖苷鍵的斷裂；當(dāng)溫度大于70℃時(shí)，隨著溫度的升高，甘露低聚糖的得率反而逐漸降低，這是由于甘露聚糖酶部分失活。

2.3 加酶量對(duì)甘露低聚糖得率的影響

加酶量對(duì)甘露低聚糖得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 加酶量對(duì)甘露低聚糖得率的影響Fig.3 The effect of the concentration of Konjac on Mannanoligosaccharides

由圖3可知，當(dāng)加酶量小于6400 U時(shí)，隨著加酶量的增加，甘露低聚糖得率逐漸增加；當(dāng)加酶量大于6400 U時(shí)，甘露低聚糖得率隨著加酶量的增加反而減小，這是因?yàn)檫^(guò)多的酶將甘露低聚糖分解成為單糖。

2.4 底物濃度對(duì)葡甘露低聚糖得率的影響

底物濃度對(duì)葡甘露低聚糖得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 魔芋精粉濃度對(duì)甘露低聚糖得率的影響Fig.4 The effect of the temperature of the reactive on Mannanoligosaccharides

由圖4可知，當(dāng)魔芋精粉濃度小于2%時(shí)，隨著魔芋精粉濃度的增大，甘露低聚糖的得率逐漸增加；當(dāng)魔芋精粉濃度大于2%時(shí)，甘露低聚糖的得率隨著魔芋精粉濃度的增大反而減小，這是因?yàn)楫?dāng)魔芋精粉濃度較高時(shí)，甘露聚糖酶只將甘露聚糖分解成聚糖，而不是形成低聚糖。

2.5 正交試驗(yàn)的結(jié)果

正交試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 正交結(jié)果及分析Table 1 The result of orthogonal

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析可知，各因素極差值大小順序?yàn)?RD＞RC＞RA＞RB，4 個(gè)因素對(duì)甘露低聚糖制備影響的主次順序?yàn)镈＞C＞A＞B。分析得知，各因素的最優(yōu)水平組合是A3B1C2D2，即魔芋精粉濃度2%、固定化酶量6400 U、溫度70℃、反應(yīng)時(shí)間17 h。在各因素的最優(yōu)水平組合條件下固定化酶法制備甘露低聚糖，重復(fù)3次進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得甘露低聚糖得率平均為30.8%。

3 小結(jié)

通過(guò)單因素試驗(yàn)和均勻試驗(yàn)得出最佳工藝條件：魔芋精粉膠濃度為2%；加酶量為6400 U；反應(yīng)溫度70℃；反應(yīng)時(shí)間17 h。在該工藝條件下甘露低聚糖得率為：30.8%。

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The Study of Production of Mannan-Oligosaccharides by Immobilized β-mannanase

YANG Wei-dong
（Baoji University of Sciences and Arts,Baoji 721007,Shaanxi,China）

2010-04-02

楊偉東（1979—），男（漢），助教，碩士研究生，研究方向：生物新材料的制備與檢測(cè)。