趙桃，馬林，李嘉佳，杜靜君，楊娟，楊凡

（上海工程技術(shù)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海201620）

黑青稞花色素的提取工藝

趙桃，馬林，李嘉佳，杜靜君，楊娟，楊凡

（上海工程技術(shù)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海201620）

研究青稞花色素的提取工藝，以黑青稞為原料,考察提取溶劑、酸化劑、提取溫度、提取時間、料液比、提取次數(shù)和籽粒粉碎度等7個單因素對其花色素提取率的影響，并采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計法建立和優(yōu)化青稞色素提取的乙醇濃度、溫度、時間的回歸方程。試驗結(jié)果表明，在試驗范圍內(nèi)各因子對青稞色素提取率的作用大小依次為：乙醇濃度＞時間＞溫度。根據(jù)優(yōu)化的回歸方程，青稞色素的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度50%，溫度53℃，時間3 h，此時最大提取率為108.33 μg/g。試驗所建立的回歸模型在試驗范圍內(nèi)能較準(zhǔn)確的預(yù)測青稞色素的提取率。

青稞；花色素；提取工藝；二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計

Abstract:Black hulless barley was used to study the optimal extraction technology of anthocyanins from hulless barley.Effects of extraction solvent,acidifying agent,temperature,time,solid-solvent ratio,frequency and particle size of material on extraction yield of anthocyanins from hulless barley were determined individually.Based on the results,a three-factor quadratic regression rotational combinational design was applied to establish a regression model and to estimate the optimal conditions for maximal extraction yield.The results showed that the contributions of the three factors were：ethanol concentration ＞time＞temperature.The optimal extractingtechnology was considered to be extracted with 50%ethanol at 53℃for 3 h and the maximum yield of the anthocyanins was 108.33 μg/g.At the range of the designed condition the mathematic regression model could forecast the extraction yield of anthocyanins from hulless barley.

Key words：hulless barley;anthocyanin;extraction technology;quadratic regression rotational combinational design

青稞（Hordeum vulgare ssp.vulgare）又稱裸大麥，是禾本科大麥屬作物，在世界許多國家和地區(qū)作為主要糧食作物已有幾千年歷史。20世紀(jì)以后，隨著稻米和小麥的食用量增加，大麥的食用量急劇減少。然而20世紀(jì)80年代以來，由于青稞豐富的營養(yǎng)成分和特有的保健品質(zhì)以及在燃料工業(yè)中的潛力，在發(fā)達(dá)國家日趨受到重視，掀起綜合研究利用的熱潮[1-5]。我國青藏高原地區(qū)是青稞的起源中心之一，擁有占全世界2/3以上的裸大麥資源，尤其富藏黑色、紫色、灰色等深色品種，如能科學(xué)合理的利用，將帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益，且對藏區(qū)農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整都將具有潛在意義。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黑色食品中的天然色素（花色苷類物質(zhì)）具有較強(qiáng)的消除體內(nèi)自由基和抗氧化作用，具有延緩衰老、預(yù)防癌癥等功效[6-8]。此外，相對于合成色素，天然色素主要來源于動植物和微生物，具有安全、健康的特點[9]，利用天然物質(zhì)提取食用、化妝品和醫(yī)用色素，成為當(dāng)今世界色素研究和發(fā)展的主要趨勢[10]。裸大麥種皮色素同屬花色苷類色素，Deguchi T.等[11]從紫色裸大麥麩皮的發(fā)酵物中提取的花色素——單寧類紫色素，可消除機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的過多自由基，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗突變和抗腫瘤等功能。目前關(guān)于對我國青稞中天然色素的相關(guān)研究還鮮報道，但通過對從西藏黑青稞種皮中的黑色素的研究發(fā)現(xiàn)，該類色素也具有優(yōu)異的抗氧化性(結(jié)果另文發(fā)表)。天然色素的提取受多個因素的影響，為使提取達(dá)到最大效率，本試驗采用單因素試驗設(shè)計與二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計相結(jié)合的方法優(yōu)化青稞色素提取工藝。二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計是將回歸正交設(shè)計與旋轉(zhuǎn)設(shè)計組合起來的一種方法，它不僅保留了回歸正交設(shè)計的優(yōu)點，如試驗布點分散均勻，試驗次數(shù)少，還部分地消除了回歸系數(shù)間的相關(guān)性，雖然犧牲部分的正交性但是獲得旋轉(zhuǎn)性，可直接找出預(yù)測值相對較優(yōu)的區(qū)域，降低了試驗成本，縮短了研究周期。它以回歸方程作為函數(shù)估算的工具，克服了正交試驗只能給出最佳因素水平組合，而無法找出整個區(qū)域上因素的最佳組合和試驗結(jié)果的最優(yōu)值的缺陷[12]。本研究首次對青稞總花色素提取工藝進(jìn)行探索，為開發(fā)利用深色裸大麥作為新型“天然、營養(yǎng)、多功能”的天然色素資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用青稞材料由西藏農(nóng)科所唐亞偉惠贈。

HH-數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海逸龍科技有限公司；pHB-4便攜式pH計：上海精密科技儀器有限公司；HR1727型攪拌機(jī)：飛利浦公司；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；AB104-N型分析天平：梅特勒-托利上海有限公司；UV-7504型單光束紫外可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司。

試驗所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 單因素試驗設(shè)計

分別單獨考察提取劑（不同濃度甲醇、乙醇和水）、酸化劑（鹽酸、三氯乙酸、酒石酸、甲酸、酒石酸、檸檬酸）、提取溫度（30、40、50、60、70、80、95 ℃）、提取時間（1、2、3、4、5 h）、料液比（1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL）、提取次數(shù)（1、2、3、4）及粉碎度（完整籽粒，20、40、60、80、100目）對青稞黑色素提取率的影響。

1.2.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇對提取率影響顯著的因子（溫度、時間、乙醇濃度）作為二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗的因素并確定其零水平和間距。

1.3 色素提取方法

稱取除雜后的青稞種子3 g置于250 mL圓底燒瓶中，加入一定體積的提取劑，于水浴鍋中回流提取。提取結(jié)束后，趁熱過濾，并收集濾液，避光放置待測。

1.4 色素提取率的測定

濾液避光冷卻至室溫后，將pH值調(diào)節(jié)為2，以提取劑作為空白，于535 nm處測定吸光度，色素的提取率按以下公式計算[13]：

式中：色素提取率，（μg/g）；A535為535 nm 下的吸光度，V為稀釋后的體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；1000為單位換算倍數(shù)（mg/g→μg/g）；98.2為花色素的平均消光系數(shù)；m為樣品重量，g。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均設(shè)置3次重復(fù)，單因素試驗數(shù)據(jù)用spss11.5進(jìn)行分析，二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗結(jié)果用DPS v8.01軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取劑的選擇

溶劑法提取活性成分時，選擇適宜的溶劑非常關(guān)鍵。天然谷物色素屬黃酮類花色苷色素，具有較強(qiáng)極性。因此，在提取時間為 1 h，料液比為 1∶10（g/mL）的室溫條件下，對常用的極性溶劑對黑青稞籽粒中花色苷的提取能力進(jìn)行測定見圖1。

圖2 乙醇濃度對黑青稞色素提取率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on extraction yield

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，色素提取率隨乙醇濃度的增加而增加,當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時提取率最高，隨后又逐漸降低。青稞色素易溶于乙醇，在水中溶解度相對較低，但水起著穿透植物細(xì)胞的作用，有助于花色苷從細(xì)胞中滲出[14]，因此選用醇-水混合物可提高提取率。根據(jù)試驗結(jié)果，確定最佳乙醇濃度為60%。

2.1.2 pH值及酸化劑的選擇

花色苷在中性和弱堿性溶液中不太穩(wěn)定，因此，提取過程通常要采用酸性溶劑。酸性溶劑在破壞植物細(xì)胞膜的同時溶解水溶性色素，但過低的pH值能改變色素的原始狀態(tài)，為了獲得更接近于天然狀態(tài)的花色苷一般可采用有機(jī)酸作為酸化劑[15]。此外，根據(jù)青稞色素的穩(wěn)定性研究，其在pH 3時穩(wěn)定性較好（另文報道），因此試驗選擇在此pH條件下，研究不同酸化劑對提取率的影響。

圖3 不同酸化劑對黑青稞色素提取率的影響Fig.3 Effect of acidifying agent on extraction yield

結(jié)果如圖3所示，相同pH值條件下以有機(jī)酸為酸化劑時提取率普遍高于鹽酸，其中以檸檬酸提取率最高。該結(jié)果與在黑米色素中的研究結(jié)果一致[16-17]，可能是由于檸檬酸酸性柔和，不會破壞花色素的結(jié)構(gòu)，對色素?zé)o不良影響[18]。因此，確定用檸檬酸為酸化劑。

2.1.3 提取溫度的選擇

提高溫度是增大花色素溶解度和溶出速率的有效途徑，但溫度過高也會加速活性成分的分解，尤其是對黃酮類具有還原活性物質(zhì)來說不宜用過高的溫度提取。此外過高的溫度在實際生產(chǎn)中會使生產(chǎn)成本增加。因此，選擇合適的提取溫度至關(guān)重要，結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對黑青稞色素提取率的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on extraction yield

如圖4所示，黑青稞提取率在30℃~70℃隨溫度升高呈增加趨勢，而大于80℃后提取率反而有所下降。這是由于溫度過高情況下，色素發(fā)生一定程度的降解，同時，溫度較高促進(jìn)可溶性蛋白質(zhì)溶出變性，溶液黏度增大影響細(xì)胞分裂，阻礙了黃酮類物質(zhì)的溶出，從而降低了花色素的提取率[19]。綜合考慮，確定最佳提

圖1 提取劑對黑青稞色素提取率的影響Fig.1 Effects of solvent on extraction yield

結(jié)果如圖1所示，乙醇-水溶液（70%乙醇）的提取率最高，甲醇-水溶液（70%甲醇）和水溶液次之，純甲醇和乙醇的提取率極低。乙醇安全廉價，提取液黏度小、易過濾、回收方便，不易發(fā)霉變質(zhì)，所以選擇乙醇-水溶液（70%甲醇）作為提取劑。

進(jìn)一步考察乙醇濃度對提取率的影響見圖2。取溫度為70℃。

2.1.4 提取時間的選擇

以pH 3（檸檬酸）的60%乙醇水溶液為提取劑，提取率隨時間的變化規(guī)律如圖5所示。

圖5 提取時間對黑青稞色素提取率的影響Fig.5 Effects of extraction time on extraction yield

在0.5 h～5 h時提取率逐漸增加。天然有機(jī)化合物在提取過程中，時間過短難以有效提取，而時間過長有效成分可能被破壞，并且造成成本的浪費?；ㄉ疹愇镔|(zhì)其本身易被氧化破壞，過長時間提取會導(dǎo)致其受熱降解[19]。因此將時間確定為時間為3 h。

2.1.5 料液比的選擇

料液比的選擇見圖6。

圖6 料液比對黑青稞色素提取率的影響Fig.6 Effect of solid-solvent ratio on extraction yield

由圖6可知，黑青稞色素提取率隨料液比的增大而升高，但當(dāng)料液比大于 1∶10（g/mL）后，提取率逐漸下降。這是由于液固兩相存在溶解平衡和吸附平衡，低溫有利于吸附，由于料液比的增大，在產(chǎn)生相同熱量的條件下，提取液溫度下降，吸附作用增強(qiáng)導(dǎo)致提取率下降[20]，同時考慮到從生產(chǎn)效率，耗能和節(jié)約成本等各方面因素，確定1∶10（g/mL）應(yīng)為最佳的料液比。

2.1.6 提取次數(shù)的選擇

提取次數(shù)的選擇見圖7。

圖7 提取次數(shù)對黑青稞色素提取率的影響Fig.7 Effects of extraction frequency on extraction rate

如圖7所示，青稞籽粒在60℃提取1 h時，提取率隨提取次數(shù)增加而提高。假定提取4次的色素總量為100%，則1、2、3次提取率分別為85.1%、96.2%、99.7%，差異不顯著（P＞0.05）。因此從節(jié)約成本，生產(chǎn)效率等各方面考慮確定進(jìn)行一次提取。

2.1.7 籽粒粉碎度的選擇

青稞籽粒含有50%以上的淀粉，在溫度較高的條件下發(fā)生糊化[21]，造成粉碎籽粒的提取液渾濁黏稠，難以過濾及測定。此外青稞色素主要存在于其種皮之中，因此確定以完整籽粒進(jìn)行色素提取。

2.2 三元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計的試驗結(jié)果

對單因素試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析（ANOVA），發(fā)現(xiàn)提取時間、溫度、和乙醇濃度對提取率的影響顯著（p＜0.05），因此以這3個因素作為正交試驗研究對象，固定其它試驗條件為：以酸化劑為檸檬酸，料液比1∶10（g/mL），完整籽粒提取一次。取試驗中效果較好的水平最為各正交試驗研究因素的零水平，并設(shè)計因素水平編碼表，見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of the test

2.2.1 正交試驗設(shè)計表及試驗結(jié)果

采用DPS軟件編制二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計表，并將試驗結(jié)果列入表2。

表2 黑青稞色素的回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計表和色素提取率Table 2 Quadratic regression rotational combinational design and extraction yield

續(xù)表2 黑青稞色素的回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計表和色素提取率Continue table 2 Quadratic regression rotational combinational design and extraction yield

2.2.2 回歸方程的建立和檢驗

利用DPS軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到影響多糖提取率的回歸方程：

式中：Y 為色素提取率（μg/g）；X1為提取溫度，℃；X2為提取時間，h；X3為乙醇濃度，%。

表3 回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗方差分析表Table 3 Variance analysis of quadratic regression rotational combinational design

2.2.3 因素重要性分析

為進(jìn)一步確定各因素色素提取率的影響程度，采用貢獻(xiàn)率法[22]對二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計結(jié)果進(jìn)行分析。F值的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換值計算公式如下：

貢獻(xiàn)率計算公式如下：

式中：Δj為第j因素對提取效果的貢獻(xiàn)的大??；Δj代表第j因素F值的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換值；Δij代表第i因素與第j因素交互作用F值的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換值;Δjj代表表第j因素二次項F值的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換值。

據(jù)表3均方比F值，可知溫度、時間、乙醇濃度對提取率的貢獻(xiàn)率分別為 Δ1=1.1083，Δ2=2.082266，Δ3=2.186386。由于 Δ3＞Δ2＞Δ1，所以各因素對提取率的作用大小依次為乙醇濃度＞時間＞溫度。

2.2.4 提取條件的優(yōu)化和驗證

優(yōu)化提取方案中Xi取值頻率分布表見表4。

表4 優(yōu)化提取方案中Xi取值頻率分布表Table 4 The probability distribution of Xiin the combined application

表3由方差分析結(jié)果可知，回歸方程的失擬性檢驗：F1＞F0.05(5，8)=1.64 不顯著，即所選的回歸模型不存在失擬因子，回歸模型是合適的。對回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗：F2＞F0.05(9，13)=8.27 極顯著，說明得到的回歸方程與試驗數(shù)據(jù)是吻合的，該數(shù)學(xué)模型成立。對回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗，在α=0.1顯著水平剔除不顯著項，得到優(yōu)化后的回歸方程：

DPS軟件分析可得，黑青稞色素提取率最高時提取方案為X1=-1.682，X2=0，X3=-1，即溫度 53℃，時間 3h，乙醇濃度50%。此時提取率為108.33 μg/g，明顯高于原試驗設(shè)計中所有處理組合的提取率。在此條件下對結(jié)果進(jìn)行驗證，實際提取率為 105.27、106.11、105.54 μg/g，與理論值間誤差小于3%，說明該回歸方程與實際情況吻合良好。

本試驗為三因素五水平，共有53=125種組合方式，其中大于88.04的方案有45個，各變量取值的頻率分布如表4所示。在95%的置信區(qū)間內(nèi)提取率大于88.04的優(yōu)化提取方案為：溫度57.20℃～61.19℃，時間2.528 h～3.189 h，乙醇濃度 51.53%～57.44%。

取優(yōu)化后浸提條件的平均值方案，X1=-1.0805，X2=-0.1415，X3=-0.5515，即溫度為 59.2 ℃，時間為2.9 h，乙醇濃度為54.5%組合方案對優(yōu)化結(jié)果驗證。此時理論值 Y=103.37 μg/g，與實測值 100.06 μg/g 非常接近（誤差為3.2%），說明該回歸模型可以較好的反映實際規(guī)律，也進(jìn)一步驗證了其合理性。

3 結(jié)論

本研究采用經(jīng)典溶劑提取法提取黑青稞色素，對儀器設(shè)備要求不高。在設(shè)計試驗時，考慮到眾多因素都對提取效率有著不同程度的影響，因此先進(jìn)行了單因素試驗，篩選出對提取效率影響顯著的因素，再通過二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗確定最佳提取工藝，有效提高了試驗的嚴(yán)謹(jǐn)性和可靠程度。試驗結(jié)論如下：

西藏黑青稞中花色苷類色素提取條件的優(yōu)化數(shù)學(xué)回歸模型為：

由回歸方程可知，在酸化劑為檸檬酸（pH 3），料液比1∶10 g/mL，完整籽粒提取一次的條件下，黑青稞花色素最佳提取工藝條件為：53℃，時間3 h，乙醇濃度50%，各因素對提取率的作用大小依次為乙醇濃度＞時間＞溫度。此數(shù)學(xué)回歸模型在試驗范圍內(nèi)能較準(zhǔn)確的預(yù)測總花色素的提取率。

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Extraction Technology of Anthocyanins from Black Hulless Barley

ZHAO Tao,MA Lin,LI Jia-jia,DU Jing-jun,YANG Juan,YANG Fan
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Shanghai University of Engineering Sciences，Shanghai 201620，China）

2009-11-07

上海市教委優(yōu)秀青年教師基金資助項目（B-8500-08-0112）；上海工程技術(shù)大學(xué)科研啟動基金（校啟08-25）；上海工程技術(shù)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新活動計劃項目（CS0904003）

趙桃（1982—），女（漢），講師，博士，研究方向：植物活性成分。