趙朋玲，鄭海濤，姜盼盼，朱學加，何計國*

(中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

兩種方法制備氟苯尼考人工抗原及其鑒定

趙朋玲，鄭海濤，姜盼盼，朱學加，何計國*

(中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

目的：通過兩種不同方法制備氟苯尼考人工抗原并將制備的人工免疫原用于動物免疫。方法：分別采用琥珀酸酐法和強堿水解法制備兩種人工半抗原(HP1和HP2)。將兩種半抗原與牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)通過活潑酯法和戊二醛法進行偶聯(lián)，制備人工免疫原和人工包被原，分別命名為HP1-BSA、HP1-OVA、HP2-BSA和HP2-OVA。分別將兩種方法合成的人工免疫原用于動物免疫，用兩種人工包被原對獲得的兩種抗血清進行評價。結果：經(jīng)質(zhì)譜、紫外光譜表征，氟苯尼考兩種半抗原均合成成功，并且與載體蛋白的偶聯(lián)比分別為12.4:1(HP1-BSA)、8.5:1(HP1-OVA)、21.8:1(HP2-BSA)、15.4:1(HP2-OVA)。動物實驗結果表明，獲得的針對HP1-BSA的抗血清與HP2-OVA包被原結合最為靈敏。結論：活潑酯法和戊二醛法均成功制備了氟苯尼考人工抗原。

氟苯尼考；抗原合成；活潑酯法；戊二醛法

Abstract：Two hapaten synthesis methods, succinic anhydride method and alkaline hydrolysis were used for florfenicol deriviazation and the synthesized hapatens, named HP1 and HP2, were separately conjugated with BAS (bovine serum albumin)by active ester method and OVA (ovalbumin) by glutaraldehyde method to obtain two immunoagents, named HP1-BAS and HP2-BAS and two coating antigens, named HP1-OVA and HP2-OVA. HP1-BAS and HP2-BAS were separately used to immunize Balb/c mice for obtaining antisera. Antisera response to HP1-BAS and HP2-BAS were evaluated for their titers using HP1-OVA and HP2-OVA. The mass spectrometric and UV spectral characterization demonstrated that HP1 and HP2 were successfully synthesized. The coupling ratios between HP1 or HP2 and BAS or OVA were determined to be 12.4:1 (HP1-BSA),8.5:1 (HP1-OVA), 21.8:1 (HP2-BSA) and 15.4:1 (HP2-OVA). The antiserum responses to HP1-BAS had the most specificity to HP2-OVA.

Key words：florfenicol；synthesis of antigen；active ester method；glutaraldehyde method

氟苯尼考是一種由美國Schering-plough公司研制的，用于治療畜禽細菌性疾病、傷寒、副傷寒、呼吸道感染的動物專用廣譜抗菌藥物[1]，具有吸收良好、體內(nèi)分布廣、抗菌譜廣的特點。由于氯霉素在食品動物中被禁止使用，氟苯尼考成為其替代品在水產(chǎn)、牲畜及禽類中使用廣泛[2-3]。目前，已在亞洲、歐洲、美洲等20多個國家上市使用[1]。氟苯尼考具有血液系統(tǒng)毒性及胚胎毒性[1]，廣泛的應用，導致其在動物食品中的殘留情況日趨嚴重，對人體健康構成潛在威脅。

目前國內(nèi)外用于檢測動物性食品中氟苯尼考殘留的主要方法有液相色譜法[4-5]、氣相色譜法[6-7]、液質(zhì)聯(lián)用[8-9]、氣質(zhì)聯(lián)用[10-11]等，均具有前處理復雜、煩瑣耗時、儀器化程度高且價格昂貴等缺點，不易推廣并應用于大批量樣品的檢測。近年來，免疫分析技術已經(jīng)越來越廣泛的應用于獸藥殘留分析領域，以其簡單、廉價、快捷、靈敏度高、適用于大批量樣品檢測等優(yōu)點而成為一種重要的分析方法。

利用氟苯尼考的結構可以設計出兩種合成半抗原的途徑，將兩種半抗原分別與載體蛋白BSA和OVA偶聯(lián)以制備相應的人工抗原，為氟苯尼考單克隆抗體的制備提供可靠的免疫原和包被原。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6周齡雌性Balb/c小鼠14只，購于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，合格證號：SCXK(京) 2006—0009。

氟苯尼考(Florfenicol，含量＞98.0%) 浙江海翔藥業(yè)股份有限公司；牛血清白蛋白(BSA)第五組分(含量＞98.0%)、卵清白蛋白(OVA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑 Sigma公司；薄層色譜硅膠預制板 煙臺市化學工業(yè)研究所；丁二酸酐(化學純) 中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司；N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 德國Merck-Schuehardt公司；N,N二環(huán)乙基碳酰亞胺(DCC)(化學純)國藥集團化學試劑有限公司；戊二醛、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(分析純) 北京化學試劑廠；乙二胺四乙酸(EDTA，純度＞99.0%) Amresco公司；4-二甲氨基吡啶(DMAP，含量＞98.0%) 上海共價化學科技有限公司；氟苯尼考標準品 Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設備

ZAB-HS質(zhì)譜儀 英國VG公司；FA1004上皿電子天平 北京東南儀誠實驗室設備有限公司；722S分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 島津分析儀器公司；Alpha-Pure純水系統(tǒng) 上海瑞楓生物科技有限公司；LGJ-10冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠；透析袋(分子質(zhì)量12000～14000D)北京拜爾迪有限公司；X-4數(shù)字顯示顯微熔點測定儀 北京泰克儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 活潑酯法合成人工抗原

1.3.1.1 氟苯尼考琥珀酸酯半抗原(HP1)的制備

精確稱取氟苯尼考2.8657g，置于圓底燒瓶中，加入40mL丙酮作為溶劑，再加入丁二酸酐2.400g及DMAP 0.0488g，加熱回流24h。反應過程中采用薄層色譜(TLC)監(jiān)測反應進程。減壓蒸餾除去反應液中的丙酮，干燥得淡黃色結晶狀粉末，即為合成產(chǎn)物。合成產(chǎn)物用數(shù)顯顯微熔點測定儀進行測定，并采用質(zhì)譜法進行鑒定，合成路線見圖1。

圖1 半抗原HP1的合成路線Fig.1 Synthetic route of HP1

1.3.1.2 人工抗原的合成[12]

將半抗原HP1與BSA偶聯(lián)制備免疫原(HP1-BSA)，合成路線見圖2。準確稱取45.8mg半抗原溶于2mL DMF中，加入20.6mg DCC和11.5mg NHS，在室溫下磁力攪拌24h。反應液2000r/min離心10min，棄去沉淀，制備氟苯尼考活化中間產(chǎn)物。

圖2 活潑酯法制備人工免疫原的合成路線Fig.2 Synthetic route of immunogen by active ester method

按載體蛋白與半抗原物質(zhì)的量的比為1:100的比例，準確稱取66.0mg BSA，溶于8mL pH7.4的PBS中，振蕩溶解，在冰水浴及磁力攪拌下，將活化中間物逐滴加入到BSA-磷酸鹽緩沖液中，4℃攪拌過夜。反應液于次日置于處理過的透析袋內(nèi)，4℃、pH7.4的PBS中透析72h，每8h換液一次。活潑酯法人工包被原的制備選用OVA載體蛋白，操作方法及各物質(zhì)所用劑量同活潑酯法人工免疫原的合成。

透析結束后，反應液用考馬斯亮藍染色法測定偶聯(lián)物的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，并結合紫外掃描圖譜計算出半抗原與載體蛋白的結合比[13]。剩余反應液分裝，－20℃保存。

式中：A為吸光度；M為相對分子質(zhì)量；c為質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

1.3.2 戊二醛法合成人工抗原

1.3.2.1 氟苯尼考胺半抗原(HP2)的制備

準確稱取5.3730g氟苯尼考及1.2800g氫氧化鈉放入圓底燒瓶中，加入15mL水作為溶劑，加熱攪拌至溶液澄清。加入3.0000g氯化鈉，再攪拌至全部溶解，冷卻至室溫后過夜，濾出固體，干燥，得到氟苯尼考胺半抗原。合成產(chǎn)物經(jīng)薄層色譜法初步鑒定，用數(shù)顯顯微熔點測定儀進行測定，并采用質(zhì)譜法進行鑒定，合成路線見圖3。

圖3 半抗原HP2的合成路線Fig.3 Synthetic route of HP2

1.3.2.2 人工抗原的合成[14-15]

將氟苯尼考胺與BSA偶聯(lián)制備免疫原(HP2-BSA)，合成路線見圖4。將24.7mg氟苯尼考胺溶于2mL DMF中，逐滴加入到含有66.0mg BSA的8mL pH7.4的PBS中。然后逐滴加入100μL戊二醛于反應液中，4℃攪拌過夜。反應液于4℃、pH7.4的PBS中透析72h，每8h換液一次。戊二醛法人工包被原的制備選用OVA載體蛋白，操作方法及各物質(zhì)所用劑量同戊二醛法人工免疫原的合成。透析結束后的反應液處理方法見1.3.1.2節(jié)中所述。

圖4 戊二醛法制備人工免疫原的合成路線Fig.4 Synthetic route of coating immunogen by glutaraldehyde method

1.3.3 動物免疫

選取14只6周齡Balb/c雌性小鼠，隨機分成兩組，每組6只，另兩只用于陰性血清對照。用兩種不同方法合成的人工免疫原HP1-BSA和HP2-BSA分別進行動物免疫，免疫劑量均為100μg/mL，首次免疫使HP1-BSA和HP2-BSA與等體積的弗氏完全佐劑乳化后注射，采用頸背部皮下多點注射方式。每兩周免疫一次，共3次，后兩次乳化劑改用弗氏不完全佐劑，免疫劑量和免疫方法同前。3次免疫后10d對小鼠進行眼眶內(nèi)齜采血0.2mL，室溫靜置1h，4℃冰箱過夜，3000r/min離心15min，收集血清，4℃保存。采用間接ELISA方法[16]，用HP1-OVA和HP2-OVA分別作為包被原對兩種免疫原進行免疫獲得的抗血清進行測定。

2 結果與分析

2.1 半抗原的結構鑒定

2.1.1 薄層色譜(TLC)監(jiān)測結果及熔點分析

薄層色譜(展開劑：氯仿:丙酮:乙酸乙酯體積比為1:1:1)結果表明，在合成氟苯尼考琥珀酸酯(HP1)的反應中，生成了不同于氟苯尼考(Rf=0.78)的新產(chǎn)物(Rf=0.64)；在合成氟苯尼考胺(HP2)的反應中，生成了不同于氟苯尼考(Rf=0.78)的新產(chǎn)物(Rf=0.43)。

在常壓室溫下，采用數(shù)顯顯微熔點測定儀對新合成產(chǎn)物進行測定表明，氟苯尼考琥珀酸酯(HP1)的熔點為99～101℃，在此溫度范圍內(nèi)，中間體全部熔為淡黃色液體；氟苯尼考胺(HP2)的熔點為161～163℃。據(jù)文獻[17]報道，氟苯尼考的熔點為152～156℃，丁二酸酐熔點為118～120℃，氟苯尼考胺的熔點為162～164℃。由此可初步判斷，HP1與HP2均為新生成物質(zhì)。

2.1.2 質(zhì)譜鑒定結果

新合成兩種半抗原HP1和HP2的質(zhì)譜鑒定結果見圖5、6。

圖5 HP1半抗原的質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrum of HP1

由圖5可見，新生成物[HP1-H]－相對分子質(zhì)量為456.0299，表明產(chǎn)生的新化合物的相對分子質(zhì)量為456.0299+1，與目標物氟苯尼考琥珀酸酯(HP1)的理論相對分子質(zhì)量457. 37基本一致，因此可推斷合成產(chǎn)物即為所需的目標產(chǎn)物HP1。

圖6 HP2半抗原的質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectrum of HP2

由圖6可見，新生成物[HP2-H]+相對分子質(zhì)量為248.1061，表明產(chǎn)生的新化合物的相對分子質(zhì)量為248.1061－1，與目標物氟苯尼考胺(HP2)的理論相對分子質(zhì)量247.28基本一致，因此可推斷合成產(chǎn)物即為所需的目標產(chǎn)物HP2。

2.2 人工抗原的鑒定

用考馬斯亮藍法[18]測定HP1-BSA、HP1-OVA、HP2-BSA、HP2-OVA中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別為3.20、3.42、10.59、12.47mg/mL。采用紫外掃描法[18]測定兩種不同方法合成的人工抗原中半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)情況。根據(jù)偶聯(lián)物中所測蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，將半抗原、載體蛋白及偶聯(lián)物均配制成200μg/mL的質(zhì)量濃度，紫外掃描圖譜見圖7～10。

圖7 HP1、BSA和HP1-BSA的紫外掃描圖譜Fig.7 UV absorption spectra of HP1, BSA and HP1-BSA

由圖7可見，偶聯(lián)物HP1-BSA與BSA在相同的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度下，HP1-BSA與載體BSA相比，吸收曲線發(fā)生了改變，且是在HP1的最大吸收范圍內(nèi)，HP1-BSA的吸光度有所增加，說明載體蛋白成功偶聯(lián)上了一定數(shù)目的小分子半抗原HP1。

圖8 HP1、OVA和HP1-OVA的紫外掃描圖譜Fig.8 UV absorption spectra of HP1, OVA and HP1-OVA

由圖8可見，偶聯(lián)物HP1-OVA的吸收曲線既具有載體蛋白的紫外吸收特征，也具備半抗原的紫外吸收特征。HP1-OVA與OVA在相同的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度下，HP1-OVA與載體OVA相比，吸收曲線發(fā)生了改變，且是在HP1的最大吸收范圍內(nèi)，HP1-OVA的吸光度有所增加，說明載體蛋白成功偶聯(lián)上了一定數(shù)目的小分子半抗原HP1。

圖9 HP2，BSA和HP2-BSA的紫外掃描圖譜Fig.9 UV absorption spectra of HP2, BSA and HP2-BSA

由圖9看出，偶聯(lián)物HP2-BSA與BSA在相同的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度下，HP2-BSA與載體BSA相比，吸收曲線發(fā)生了改變，且是在HP2的最大吸收范圍內(nèi)，HP2-BSA的吸光度有所增加，說明載體蛋白成功偶聯(lián)上了一定數(shù)目的小分子半抗原HP2。

圖10 HP2，OVA和HP2-OVA的紫外掃描圖譜Fig.10 UV absorption spectra of HP2, OVA and HP2-OVA

由圖10看出，偶聯(lián)物HP2-OVA的吸收曲線既具有載體蛋白的紫外吸收特征，也具備半抗原的紫外吸收特征。HP2-OVA與OVA在相同的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度下，HP2-OVA與載體OVA相比，吸收曲線發(fā)生了改變，且是在HP2的最大吸收范圍內(nèi)，HP2-OVA的吸光度有所增加，說明載體蛋白成功偶聯(lián)上了一定數(shù)目的小分子半抗原HP2。

常用的人工抗原結合比的測定方法是紫外光譜法。根據(jù)上述所測各人工抗原紫外掃描圖譜中278nm波長處偶聯(lián)物與蛋白質(zhì)的吸光度，計算得各半抗原與載體蛋白的結合比分別為12.4:1(HP1-BSA)、8.5:1(HP1-OVA)、21.8:1 (HP2-BSA)、15.4:1 (HP2-OVA)。

2.3 小鼠血清測定結果

用兩種包被原分別對兩種免疫原免疫獲得的小鼠抗血清進行測定，結果見表1。

表1 以HP1-OVA與HP2-OVA為包被原測定氟苯尼考對小鼠抗血清的半抑制濃度Table 1 IC50of mouse antisera response to HP1-BAS and HP2-BAS assayed using HP1-OVA or HP2-OVA as coating antigen

由表1可見，用HP1-BSA免疫獲得的抗血清在以HP2-OVA為包被原時，與氟苯尼考小分子的親和力最好，包被原的異源性顯著提高了檢測的靈敏度，半數(shù)抑制濃度(IC50)達到0.28μg/mL。

3 討 論

3.1 半抗原的合成

在獸藥殘留的免疫分析中，人工抗原的合成是抗體制備和免疫分析方法建立中最關鍵的步驟，而半抗原的合成是獸藥殘留免疫分析中最基礎的步驟。半抗原設計的關鍵在于盡可能保留原待測物的特征結構，并在適當?shù)奈恢靡牒线m的間隔臂和與載體蛋白偶聯(lián)的活性基團。

Kim等[19-20]發(fā)現(xiàn)在制備免疫原和包被原時，使用不同結構的連接臂、采用不同的偶聯(lián)方法或改變連接臂的引入位置，則可以大大提高ELISA檢測的靈敏度。沈建忠等[21]在建立馬杜霉素酶聯(lián)免疫檢測方法過程中，在制備免疫原時以半抗原的羧基為活性位點與載體蛋白的氨基偶聯(lián)，而包被原的制備則使用引入帶有氨基連接臂半抗原與載體蛋白的羧基偶聯(lián)，通過改變半抗原與免疫原和包被原的鍵合方式，使檢測靈敏度提高了2～3倍。分析認為，半抗原的結構特征及其與載體蛋白連接的間隔臂會影響人工抗原的免疫效果，這樣可以消除多克隆抗體對間隔臂的識別能力，使抗體與包被原上的可識別位點減少，降低抗體對包被原的親和力，通過異源分析降低抗體對間隔臂的識別能力從而增強抗體對目標化合物的識別能力。

為能與載體蛋白相偶聯(lián)，小分子物質(zhì)必須具備能與載體蛋白偶聯(lián)的功能性基團(－COOH、－NH2、－OH、－SH等)。本研究根據(jù)氟苯尼考分子結構上既無羧基又無氨基、不能直接與載體蛋白相聯(lián)的結構特征，采用兩種方法對其結構進行改造，使得兩種半抗原與蛋白相連接的間隔臂以及連接位點均不同。一種方法是利用氟苯尼考分子上所帶的羥基，采用活潑酯法將其活化成具有羧基(－COOH)的活性半抗原，然后與蛋白上的氨基相連，合成含CO－NH鍵的抗原。另外一種方法是將氟苯尼考分子上的酰胺鍵用強堿水解，生成氟苯尼考胺，借助戊二醛兩端的醛基與半抗原和載體蛋白的氨基以共價鍵連接。本研究證實間隔臂結構的改變明顯提高了抗血清與小分子待測物的特異性結合能力，與前人研究結果相一致。

3.2 人工抗原的合成

由于氟苯尼考是小分子物質(zhì)，只可以被B細胞表面的抗原識別受體所識別，無法引發(fā)T細胞對B細胞的輔助作用來活化B細胞，因此就需要將其連接到一個載體蛋白上，借助載體T細胞表位間接誘導B細胞，產(chǎn)生免疫應答和針對免疫原的特異性抗體。在人工抗原的合成中，要注意盡量保留人工抗原中原有半抗原的原始立體構象和電子分布特征，半抗原分子越少，越應注意保留其特征基團不被改變，實驗中要盡量避免使用其特征性的官能團用以交聯(lián)反應[22]。因此，在不改變兩種氟苯尼考半抗原特征性結構的前提下，采用活潑酯法和戊二醛法同時合成免疫原和包被原，使兩種方法合成的人工抗原間隔臂結構不同，期望制備出對氟苯尼考小分子特異性強、選擇性好、對間隔臂親和性低的抗體。同時為了避免載體蛋白之間的交叉反應，本實驗制備免疫原和包被原分別用的是牛血清白蛋白和卵清蛋白。

由于半抗原的特異性不僅取決于半抗原整個分子或部分結構的性質(zhì)，還與其人工抗原中載體上連接的半抗原數(shù)目有關。因此在免疫前，測定合成的人工抗原載體上連接的半抗原數(shù)目是非常必要和重要的。通常每一載體上含有8～25個半抗原時能取得較好的免疫效果[23]，本研究用活潑酯法和戊二醛法分別合成了兩種免疫原和包被原，計算出的結合比均在此最適結合比范圍內(nèi)，理論上應能得到效價較高的抗體，動物免疫表明，兩種免疫原所免疫的老鼠效價均在8000以上，為下一步特異性單克隆抗體的制備提供參考。

4 結 論

活潑酯法和戊二醛法均成功的合成了免疫原和包被原，偶聯(lián)比分別為12.4:1(HP1-BSA)、8.5:1(HP1-OVA)、21.8:1 (HP2-BSA)、15.4:1 (HP2-OVA) ，可以用于下一步單克隆抗體的制備及免疫學快速檢測方法的建立。

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Preparation of Haptens by Two Different Methods for Immunoassay Determination of Florfenicol and Their Identification

ZHAO Peng-ling，ZHENG Hai-tao，JIANG Pan-pan，ZHU Xue-jia，HE Ji-guo*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

TS201.2

A

1002-6630(2010)15-0225-06

2010-04-18

趙朋玲(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)與衛(wèi)生。E-mail：zhaopengling1128@yahoo.cn

*通信作者：何計國(1966—)，男，副教授，研究方向為營養(yǎng)學、食品衛(wèi)生與安全。E-mail：hejiguo0870@sina.com